全8件 ( 1 〜 8 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.2789-11 - 2009/02/03 (火) 19:45:58 - 良性 >[Re:8] APさんは書きました : > >このPCRバッファーはPCR反応後、制限酵素を添加するだけで > 制限酵素反応が上手くいくと記載してあったのでいけると思ったのですが。 > > これは制限酵素によって差があるし、推奨バッファーと同じくらい完全・正確にいくとは思わない方がいいと思います。 確かに仰るとおりです。 そのアプリケーションには酵素により上手くいかないと書いていました。 そこでＰＣＲ反応系を半分（12.5）にし制限酵素バッファーを 添加するプロトコルに改変しました。酵素だけ添加するプロトコルだと 入れ忘れに気づかないのもありますが。 >[Re:7] APさんは書きました : > たしかに、PCR産物を精製してから次の操作というのは基本ですが、クローニング等ならともかく、大規模なタイピングをしようとするときなど、なるべくステップを省いたプロトコールが賢いですよね。 > > だめなら、より高塩濃度で働くisoschizomerであるCseIに変えてみては。 おっ、HgaIのイソシジマーにはきづきませんでした。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.2789-9 - 2009/02/03 (火) 19:19:45 - 良性 > > PCRの増えがよければ、反応溶液中のPCR溶液の割合を減らせば改善されるかもしれません。もしサイクル数を増やして（30→40とか）大した非特異産物の出現もなく目指すプロダクトが増えるなら、制限酵素反応に加える体積を減らすことができますね。 そうですねＰＣＲ反応液の量を減らすのも手でしたね。 できるだけ手順を減らしたいとばかり考えて 頭の片隅から消えていました。 > > それか、メーカーにより推奨バッファーが異なる場合があるので、それに従っていろいろ試すのも手かもしれません（最近では、NEBの4がやたらいろんな酵素に使えるとか） 一応、HgaIはNEB1/4で切断効率が良いとのことでしたので 先の条件で試みました。 結果、NEB1の方が切断効率は良かったです。 NEB1と4はPHが7と7.9、PCRbuffer PH8.5 HgaI　PH8以上でスター活性示す可能性あり なのでやはりPCRbufferのＰＨ等の影響が切断に悪影響を 及ぼしていた様ですね。

(無題) 削除/引用 No.2789-8 - 2009/02/03 (火) 19:18:03 - AP >このPCRバッファーはPCR反応後、制限酵素を添加するだけで 制限酵素反応が上手くいくと記載してあったのでいけると思ったのですが。 これは制限酵素によって差があるし、推奨バッファーと同じくらい完全・正確にいくとは思わない方がいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2789-7 - 2009/02/03 (火) 19:15:23 - AP たしかに、PCR産物を精製してから次の操作というのは基本ですが、クローニング等ならともかく、大規模なタイピングをしようとするときなど、なるべくステップを省いたプロトコールが賢いですよね。 PCRバッファーは、酵素によって違うでしょうが50 mM KClのような塩を含みます。一方、手元の資料だと、HgaIはBuffer 1 (塩濃度0)となっています。一般に至適より塩濃度が高くなると（とくに塩濃度0が推奨のばあい）制限酵素は切れなくなります（逆に低いとスター活性がでやすい）。 なので、余計に塩を足すことになるBuffer 2を省いたレシピを試してみてはどうでしょうか。 だめなら、より高塩濃度で働くisoschizomerであるCseIに変えてみては。

(無題) 削除/引用 No.2789-6 - 2009/02/03 (火) 19:01:42 - 良性 DSC、onso9さん ありがとうございます。 やはりそうですか。 このPCRバッファーはPCR反応後、制限酵素を添加するだけで 制限酵素反応が上手くいくと記載してあったのでいけると思ったのですが。 Onso9さんのご指摘のとおり、 HgaIは結構扱いにくい酵素みたいですし クリーンアップ後、制限酵素処理することにします。 追加 今現在、PCR産物のクリーンアップはキアゲンの minELute PCR purification kitを用いているのですが もっと安く定評のあるクリーンアップキットをご存知の 方がいらっしゃたら、お教え下さい。

(無題) 削除/引用 No.2789-5 - 2009/02/03 (火) 18:37:50 - onso9 DSCさんと同意見です。 PCR産物を精製したのち制限酵素処理を行うのが第一選択のような気がします。 NEBのカタログによるとHga�Tはph8＞でスター活性を示すことがあるようです。

(無題) 削除/引用 No.2789-4 - 2009/02/03 (火) 18:33:53 - DSC そもそも、PCRプロダクトを精製なしで別の反応にもっていくというのは邪道ですよね。楽だし、うまくいくときはいくので、ふつうにまかり通っていますけど。PCR反応溶液が半量を超えていたら、うまく切れなくて当たり前な気がします。制限酵素用のバッファーよりもPCR用のバッファーの組成の影響が大きいわけですから。もちろん、酵素の種類によってうまく切れるものもあるというのもわかります。 PCRの増えがよければ、反応溶液中のPCR溶液の割合を減らせば改善されるかもしれません。もしサイクル数を増やして（30→40とか）大した非特異産物の出現もなく目指すプロダクトが増えるなら、制限酵素反応に加える体積を減らすことができますね。それか、メーカーにより推奨バッファーが異なる場合があるので、それに従っていろいろ試すのも手かもしれません（最近では、NEBの4がやたらいろんな酵素に使えるとか）。それでダメなら、精製（エタ沈・限外ろ過・ゲルろ過 etc.）を経るしかないのでは？

PCR産物の制限酵素処理 削除/引用 No.2789-1 - 2009/02/03 (火) 18:14:57 - 良性 現在、PCR産物を制限酵素処理しgenotypeの決定をおこなっております。 一部の制限酵素では下記のような条件で上手く系が動いております。 しかしながら、制限酵素HgaIを用いたときは 制限酵素の量、反応時間、PCR産物量、制限酵素バッファー を変化させたりしたのですが切断が不十分で上手く系が構築できません。 上手くいっていない原因として、 PCR反応液と制限酵素の相性が 悪いのかなと予想しているのですが。 PCRバッファーの詳しい組成は不明ですが PH8.5 3MgCl2が含まれているようです。 どなたか、似たような経験ございませんでしょうか。 PCR産物(100ｎg相当 in PCRバッファー）　12.5 制限酵素用バッファー　2 制限酵素 2~0.5U 水 up to 20 至適温度　4H処理

全8件 ( 1 〜 8 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---