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(無題) 削除/引用 No.2785-11 - 2009/02/07 (土) 02:28:07 - BBB 培養細胞なら最近よくやられてるように、controlか処理群どちらかをサイラックで標識しておいてIPして両者混ぜてそれをマスマスで解析ということでいいのでは。どの蛋白質のどの残基の修飾がどのくらい変化したか分かるでしょう。IPにも十分つかえる優秀な抗体を手に入れるのが重要ですね。

(無題) 削除/引用 No.2785-10 - 2009/02/07 (土) 02:20:36 - BBB 培養細胞ならサイラックで標識して

(無題) 削除/引用 No.2785-9 - 2009/02/05 (木) 20:46:45 - おお >[Re:8] 中年さんは書きました : > また、ノーデータとはどういう意味ですか。 > > それはノーデータなのではなく、そのタンパク質が問題のチロシンリン酸化タンパク質でないことをきっちり否定しているデータでしょう。 いいですね。そういう風に考える人が いがいとすくないんですよね。 ということで、一歩前進です。 Maaさん,だいたい、ほかにペプチドはひっかかってないんですか? >[Re:5] Maaさんは書きました : > 皆様、ご回答ありがとうございました。 > > > そこで、ここがまずかったのですが、ウエスタンで大きく違うチロシンリン酸化タンパクのバンド部分を切り出して、シークエンスにかけたんです。 > たぶん、このステップは二次元電気泳動でやるべきだったんだと反省しています。 > 問題点の考察ができているのに、なぜ改良を施さないのでしょうか。 前進あるのみです。 2Dのほかに、ant-pYでIPしてから、そのバンドをきりだすとか いう方法も取れるのでは、そうしてpYを含むペプチドという視点で マスのでーたー をみるというのもてです。

(無題) 削除/引用 No.2785-8 - 2009/02/05 (木) 16:58:37 - 中年 また、ノーデータとはどういう意味ですか。 IP前とIP後のサンプルに含まれる当該タンパク質の量を、そのタンパク質に対するウェスタンのシグナル強度を基準にして揃え、その後、同じ量のサンプルを抗リン酸化チロシン抗体でウェスタンしてIP後のサンプルでリン酸化が確認されないとしたら、それはノーデータなのではなく、そのタンパク質が問題のチロシンリン酸化タンパク質でないことをきっちり否定しているデータでしょう。

(無題) 削除/引用 No.2785-7 - 2009/02/05 (木) 16:41:37 - 中年 おおさんが最初にお書きになっているように、その方法ではバンドの位置に共在している量の多いタンパク質が同定されるだけなので、同定されたタンパク質が問題のリン酸化タンパク質であることを期待するのは無謀だと思います。4G10などの抗リン酸化チロシン抗体は感度が高いので、銀染で見えないような量のタンパク質でもウェスタンでばっちりバンドが出ます。

説明させてください 削除/引用 No.2785-5 - 2009/02/05 (木) 16:33:06 - Maa 皆様、ご回答ありがとうございました。 かなりアバウトな説明だったので、わかりづらいと思います。大変申し訳なかったです。 ですので、説明させてください。 まずは、細胞に刺激を加えることで、細胞凝集が起こることが知られている方法があります。ここでは仮名（AA）という物質を作用させるとチロシンリン酸化シグナルを発生させながら、細胞凝集が起こると考えてください。 　そこで、私たちが精製した物質BがこのAA刺激で引き起こされる細胞凝集を抑制することから、細胞内でのチロシンリン酸化に大きな違いがないかと考えて、そのリン酸化タンパクの挙動を見たところ、リン酸化に大きな違いが確認できました。 そこで、ここがまずかったのですが、ウエスタンで大きく違うチロシンリン酸化タンパクのバンド部分を切り出して、シークエンスにかけたんです。 たぶん、このステップは二次元電気泳動でやるべきだったんだと反省しています。 　その後ですが、候補たんぱく質の抗体を使って、同様のAA刺激とAA+B刺激の細胞溶解液に免沈によりタンパクをより分け、そのタンパクのリン酸化に大きな違いがないかをウエスタンにより確認していますが、２、３ヶ月ノーデータなんです・・・・・。 よかったら、アイディアをまた、聞かせてください。

(無題) 削除/引用 No.2785-4 - 2009/02/03 (火) 18:06:46 - TS 仮同定したタンパク質が、実際にリン酸化を受けているのかを証明したいということで良いのでしょうか？ それで、IP:目的タンパク質、IB:pS, pT, pYのどれかをやっているのですか？ それとも、IPの後に、塩酸分解後にリン酸化アミノ酸を2D-TLCで見てるのですか？ その辺の情報がないと、答えにくいです。

(無題) 削除/引用 No.2785-3 - 2009/02/03 (火) 17:52:03 - とも リン酸化をウエスタンでみるとき、ホスファターゼインヒビターとかはつかっていますか？？ あとリン酸化されるタンパクを大腸菌で作らせて、精製して、そのタンパクがリン酸化されるかをセルラーセート使ってみるキットがプロメガからでていますよ。ATPの消費量をみるらしいです。 刺激しないライセートまたは刺激入れたライセートでみればいいのではないかな？ あとリン酸化サイトがわかっているのであれば、そのサイトをアスパラギン酸やグルタミン酸なんかに変えて、疑似リン酸化状態を作って実験するやり方もありますよ。

(無題) 削除/引用 No.2785-2 - 2009/02/03 (火) 16:09:28 - おお 実験のプロセスがよく分かりません。 ウエスタンは燐酸かしたアミノ酸の抗体ですか? でトータルライセーとからバンドの部分切出しなら 相当いろいろなものが交じっていると思いますが。 トリッキーですが、燐酸かたんぱく質を回収できる カラムがきアーゲンがうっています。 あるいは2Dで解析した方がいいかもしれません。

リン酸化タンパクの同定 削除/引用 No.2785-1 - 2009/02/03 (火) 15:36:58 - Maa 実験がうまくいかずに困っています。 細胞に刺激を加えて、リン酸化シグナルの違いを見ているのですが、そのタンパク質の同定に数ヶ月以上かけています。なにかいい方法はないでしょうか？ 今は、ウエスタンブロットでリン酸化の違いを見つけて、そのバンド部分を切り出して、ペプチドシークエンスをかけて、二つの候補があがってきたのですが、実際に刺激によりこのタンパク質がリン酸化されているかいないかを免疫沈降で捕まえてきたタンパク質がリン酸化しているかどうかを見ていますが、この数ヶ月、まったくいい結果がでていません。 　ただ単に候補のタンパクがリン酸化に関係がないのかもしれませんが、細胞からリン酸化タンパク質を同定するいい方法があれば教えてください。

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