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(無題) 削除/引用 No.2782-12 - 2009/02/03 (火) 20:08:04 - 中年 書き忘れていましたが、前培養は抗生物質を入れて行うのが作法だと思いますが、本培養の方は抗生物質を除いた方が大腸菌がhappyで効率も上がると思います。

(無題) 削除/引用 No.2782-11 - 2009/02/03 (火) 19:31:30 - ザンギ >井上さんに何かの賞を差し上げたい気持ちです。 賛同します。素晴らしいですね。

(無題) 削除/引用 No.2782-10 - 2009/02/03 (火) 19:23:21 - 中年 集菌時の最適OD値が菌株によって異なるというのはあるかと思いますが、これまでカルシウム法の効率で満足しておられたのであれば、多少のODの違いは全く問題にならないと思います。また、APさんがお書きになっているように、井上法はODの違いにかなり寛容です。 溶液を作るのは確かにちょっと手間ですが、私は1L作って必要な分だけ使い、残りは４℃に取っておいて次の時に使うというやり方で、もう１年以上使っていて特に効率の低下もありません。 コツがあるとしたら、どの一瞬も菌の懸濁液を温めない（例えばチューブを温い手指で不用意に掴まない、全ての器具やチューブを十分に冷やしておく）ことと、懸濁を速やかかつ十分にする（ボルテックスは時間が掛かる上に飛散することがあるので使わない。10mLピペット＋大型ニップルで吹き付けるように懸濁。ただし泡立てないこと。）ことくらいでしょうか。 私個人としては、この方法を開発した井上さんに何かの賞を差し上げたい気持ちです。同意してくださる方も多いのではないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2782-9 - 2009/02/03 (火) 17:55:07 - レレレ AP様 ありがとうございます。 井上法にはその様なメリットもあるんですね。 わかりやすい解説をありがとうございます。 Molecular Cloningを読んでみたのですが、確かに懸濁液はちょっと複雑ですね。塩化カルシウム法と比べると手間がかかるのかな?という印象です。 ただ、良いコンピテンシーを得られるのに越したこと無いですよね。 もう少し、Molecular Cloningを読み込もうと思います。

ABLE C株コンピテントセル作製 削除/引用 No.2782-8 - 2009/02/03 (火) 17:42:49 - レレレ 中年様 ありがとうございます。 作製時のポイント(ここを気をつける、とか)について仰っているのかと思いました(汗)お恥ずかしい… 「コツが無くても」というのはすごいですね(他の研究室では当たり前のように作っているのでしょうが…) ただ、集菌時の最適OD600値は大腸菌株によって異なる(JM109株は0.6〜0.7、HB101株は0.4とか)と聞いていますので、ABLE株の場合はどうなのだろうと思って質問させて頂いたのですが。 コンピ作りに慣れていたらそれ程意識しないでやっているものなのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2782-7 - 2009/02/03 (火) 17:31:06 - AP 理由はよくわかりませんが、37℃で培養した場合はOD600=0.5をピークにその前後では急激に形質転換効率が下がるのに対し、18℃で培養するとそれを上回る形質転換効率が0.4〜0.8までほとんど変化なく保たれるということが、彼らの報告にあります。低温培養なので、うっかり培養しすぎて最適値を過ぎてしまうということも起きにくいです。 また、ハナハン法やCaCl2法に比べると、ligation反応液組成の持ち込みによる効率低下も起こりにくいとも主張されています。 培養に時間がかかる（2日間くらい）のと、懸濁液が多少複雑（CaCl2のほかにPIPES buff、KCl）なのを除けば、基本的にはCaCl2法と操作にたいした違いはないので、CaCl2法をやるくらいなら、Inoue法で、、、と私は思いますけれど。

(無題) 削除/引用 No.2782-6 - 2009/02/03 (火) 17:09:40 - 中年 APさんが仰っているのは、「ポイントは、（中略）培養を止めるタイミング（OD値）がクリティカルでなくなるところです」ということで、井上法の長所について説明されているだけです。 井上法は書いてある通りにやれば、特にコツもなく高効率が出せます。いつもカルシウム法でやっておられたとしたらビックリされると思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.2782-5 - 2009/02/03 (火) 16:43:37 - レレレ AP様 返信ありがとうございます。 井上・野島法は以前にも調べたことがあったのですが、 やはり形質転換効率は非常にいいようですね。 あと、申し訳ございませんが、 「OD値がクリティカルで無くなるところ」とは、 細胞がどのような状態にある時でしょうか?(初歩的質問でしたらすみません) growth curveを作製した場合の、対数増殖期にあたる状態なのでしょうか? お手数おかけします。

ABLE C株コンピテントセル作製 削除/引用 No.2782-4 - 2009/02/03 (火) 16:05:40 - レレレ おお様 返信ありがとうございます。 …やはり塩化カルシウム法は効率悪いんですかね。 実は以前に、塩化カルシウム法でABLE C株のコンピを作った人がいまして、 形質転換効率自体は悪かったのですが、それを使ったら長大なコンストラクト(ベクター4000bp、インサート3500bp)を得ることが出来たんです。 その作り方を当人に聞いたら、OD値までは測っていなかったとのことなので、もし最適OD値がわかれば…と思っていたのですが。 私の研究室では、今までのところ塩化カルシウム法でしかコンピテントセル作製したことがないので、Hanahan法や井上法に慣れている人がいません。 むしろ、「何それ?」って聞き返されます。 なので、自分で井上法を試してみようと思います。 結構ドキドキものですが。

(無題) 削除/引用 No.2782-3 - 2009/02/03 (火) 15:06:58 - AP CaCl2法は作りたてでも効率が良くないし、凍結保存するとほとんど使い物にならないと思っていいです。 どうせ自前で作るなら、Inoue/Nojimaの方法がいいでしょう。 ポイントは低温で培養することで、competenceの高いフェイズを長く保つところで、 >コンピを作るにあたり集菌時のOD660の値がかなり重要なので、是非教えていただきたいです。 培養を止めるタイミング（OD値）がクリティカルでなくなるところです。

(無題) 削除/引用 No.2782-2 - 2009/02/03 (火) 14:44:39 - おお 漏れキュラークローニングにも基本的なコンピの作り方 はのってます。塩化カルシウムを必ず使わないと いけませんか?もっと効率のいい方法がのってますよ。 ライゲーションしたりする場合はきっと塩化カルシウム では話にならないと思います。 とくにOD値が大事と仰っているので、効率を かなり意識しているのかと思いますし、、、 この株ってかなり曲者ではなかったかとおもったのですが、、、

ABLE C株コンピテントセル作製 削除/引用 No.2782-1 - 2009/02/03 (火) 13:10:50 - レレレ Stratagene社のABLE株のコンピテントセルを作製したことのある方にお聞きしたいことがあります。 塩化カルシウム法を使ってABLE C株のコンピテントセルを作製しようと思っています。 私の場合シングルコロニーをつつき、5mLのLB液体培地(抗生物質Tet、Kan添加)で前培養後、50mLのLB液体培地(抗生物質Tet、Kan添加)で本培養を行ったあとで集菌を行っているのですが、皆さんはOD660がどの値になった時に集菌を行うようにしていらっしゃいますか? Stratagene社のHPからプロトコール等がダウンロードできるのではないかと思い、探してみましたが結局それらしきものが見当たりませんでした。(私が単に見落としているだけなのかもしれませんが…) コンピを作るにあたり集菌時のOD660の値がかなり重要なので、是非教えていただきたいです。 あと何か情報が不足していれば、指摘してください。 よろしくお願いいたします。

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