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(無題) 削除/引用 No.2780-6 - 2009/02/04 (水) 22:46:03 - ハチ おおさん、有用な情報をありがとうございます。 確かにそれぐらいの長さだとPCRでも設計できそうです。 やはり、既に報告があるベクターの配列を使用する方が無難なようですね。 ただ、私が使用しているのは、いわゆるモデル動物でないのです。 他の生物のゲノムからイントロン等を使用して上手く働くか 少し心配ですが、エクソン-イントロンのスプライシングメカニズムは 結構保存されていそうですので、まずはやってみます。 他にも情報をお持ちの方、知恵を貸してください。

(無題) 削除/引用 No.2780-5 - 2009/02/04 (水) 15:53:40 - おお http://bssv01.lancs.ac.uk/ADS/BIOS336/336L10.html ぐぐったのですがこのあたりが無難かな、リファレンスもありますし。 ブランチポイントはここの情報によればスプライシングサイトより 25ベースほど上流です。 ですからちょっと長いプライマーをつくるか、ネストで端を伸ばせば できると思います。 基本的にイントロンは80ベースぐらいあれば機能します。 73(だったかな)いかで機能しなくなったという文献が あったと思います。 あまり自分で配列デザインするより、市販のトラップベクターや イントロンをわざと挿入している発現ベクターの配列を しらべて、同じ配列にした方がいいと思います。 トラップベクターなんかは私も数種類文献を読んだ 覚えがありますので、そういうのと同じ配列を使うのも てだとおもいます(情報は手に入るわけですし)。

(無題) 削除/引用 No.2780-4 - 2009/02/03 (火) 16:37:23 - ハチ おおさん、DSCさん 返信ありがとうございます。 ブランチポイントがいるとなると、PCRプライマーにSD or SA siteを付加して(制限酵素サイト付加プライマーみたいに)作製するのは厳しいんでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2780-3 - 2009/02/03 (火) 14:35:10 - DSC 回答ではなく恐縮ですが、、、 イントロン（約1.5kb）を含む遺伝子のコンストラクトを哺乳類細胞に導入したのですが、わけあって3'-siteから200bpほど上流に変異を入れていたら、そのイントロンのスプライシングの効率が非常に低くなってしまいました。そこにブランチポイントがあったのかなーと思っています。 3'-siteからどれくらい上流まで温存しておけば確実なのでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.2780-2 - 2009/02/03 (火) 10:56:43 - おお トラップベクターは作ったことはないですが ブランチポイントはいると思います。 詳しくは余裕があればあとで書きますが、

有効なsplice acceptor (SA)、donor (SD) の長さと配列は？ 削除/引用 No.2780-1 - 2009/02/03 (火) 05:52:33 - ハチ いつもお世話になっています。 現在、exon trap vector等に使用するための有効なsplice acceptor (SA) or splice donor (SD) の長さと配列について調べています and 困っています。 --<<-----AG|atc----EGFP-----ag|GT----->>-- (SA site) (SD site) 上記のようなコンストラクトを作りたい場合の、SA or SD siteの配列はどのようにすべきでしょうか？ ラボの同僚は、下記のような mag|GTragt-----------ynyAG|gk mag|GTragt-------−-yyyncAG|g |: exon-intron junction k: g or t m: a or c n: any r: a or g y: c or t ジャンクションから数bp特定の配列を付加した配列であれば良いと教えてくれたのですが、 ブランチサイト(A)等を含まなくても良いものなんでしょうか？ 上記のような配列で良いのであればPCRで増やせて都合が良いのですが。 やはり、ゲノムからイントロン部位の配列を(数十bp程度)用いた方が良いのでしょうか？ その場合用いる部位により多少配列が異なるような気がし、影響を心配しています。 どなたかSA, SDを付加したコンストラクとを作製したことが有る方、 trap vectorに詳しい方よろしくお願いします。 さらに、SA siteの5'上流にはstop/start siteをもうけた方が良いのかも、 あわせて質問させてください。

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