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(無題) 削除/引用 No.2779-4 - 2009/02/05 (木) 04:37:52 - AP メーカーも試薬の内容を公表していないようなので、はっきりとはしませんが、T4 DNA polymeraseとT4 polynucleotide kinaseを同時に働かせる系のようです。 T4 polを使ったbluntingはトリッキーなところがあって、しばしば3' exonuclease活性による過剰な削れこみが起こって失敗します。キットだとスケールや酵素の量の調節ができないので、たとえばDNA量がキットの想定より少ない場合など、酵素過剰でそういうことが起こりがちです。 また、熱失活は失活温度に達して完全に失活するまでのあいだに、高温でインキュベートすることになり、これが3' exo活性を促進する危険性があります。経験上でも、熱失活せずにフェノール抽出したほうが結果がよいです。 T4 PNKは酵素や試薬がへたっていない限り問題が起こることはないと思いますが、アンモニウムイオンで阻害されるので、NH4OAcでエタノール沈殿したDNAを使うとうまくいかない可能性があります。PCRで調製したDNAだと、PCR bufferには(NH4)2SO4が入っているものもありますので、そのまま持ち込むのはマズいでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.2779-3 - 2009/02/03 (火) 10:51:09 - Pumpkin えーと、ライゲーションも長過ぎではないでしょうか。マニュアルには1-2 hrsと書いてあるので、ライゲーションの促進剤が入っていると思いますので、不用意に長過ぎるのはよくないと思いますよ。。。

(無題) 削除/引用 No.2779-2 - 2009/02/03 (火) 10:48:35 - Pumpkin もう少し詳細なプロトコールを提示すすることを激しくお勧めします。でないと、kitの問題なのか、手技の問題なのかは分からないと思います。広く一般に質問してるのであれば、「反応系」をきちっと明示したらいかがですか。室温30分という表記を反応系として書きこまれては何が何だかわかりません。 Perfectly Blunt kitのマニュアルをリンクさせておけば、回答してくれる方も増えるかもしれません。 さらっと読むと、end conversionは22℃, 15minと書いてあるし、カルベニシリンの代わりにアンピシリンでセレクション書けると形質転換体が取れないことがあるという注意書きに対してはいかがですか。

NovagenのPerfectly Blunt kitについて教えて下さい。 削除/引用 No.2779-1 - 2009/02/03 (火) 01:12:32 - 末端君 もともと平滑末端のものをリン酸化だけしようと考えています。 PNKもあるのですが、たまたNovagenのPerfectly Blunt kitがありまして、 こちらの方がkit化されているため手順が簡便かと思い、 R.T 30minで反応させ、72℃ 10minで失活させ、ligationを16℃O/Nで行いました。 しかし結果はnegativeでした。何か反応系で問題がありますでしょうか。 ご教授頂ければ幸いです。

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