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(無題) 削除/引用 No.2772-7 - 2009/02/02 (月) 14:51:20 - EcoRI 大腸菌でS-Sがかからない、という話が出たので… Origami BとかRosetta-gamiなどの菌株は、大腸菌菌体内のpHを保つ遺伝子に変異が加えられていて、 普通のBL21よりは、S-Sがかかりやすい、と言われています。 なので、膜タンパクの細胞外ドメインを作るときは、そういったことも視野にいれておいてもいいかもしれません。 いずれにしても、糖鎖修飾は起きないので、functionalな抗体は難しいかも…。

(無題) 削除/引用 No.2772-6 - 2009/02/02 (月) 14:13:07 - fish 余談ですが、確か月田先生がオクルーディンとられたときに、 SDSを加えた膜分画、膜分画のみ、の二種類でウサギに免疫して抗体を取得し、内在性のタンパクをきちんと認識してうまくいったのは、SDSを入れて免疫したほうだったというのを聞いたことがあります。(間違ってたらすみません..) 膜分画に存在するタンパクの抗体作成は難しく、ちょっとしたセンスがいるんだなと感じました。大腸菌で作成したタンパクでは、糖鎖修飾やS-Sを介したholdingがないと考えられますので、認識しないことなんて多々あるだろうなと思います。あまり答えになっていませんが、参考になれば。

(無題) 削除/引用 No.2772-5 - 2009/02/02 (月) 11:05:52 - あるば 膜タンパクのウェスタンは、内在性タンパク質よりもかなりレベルが高いと感じています。 周りが内在性ばかりで膜タンパクをやってないと、下手くそと言われて 哀しい限りですが…（まぁその通りといえばその通りですが）。 上手いこと検出するまでに検討する項目は抗体に限りません。 もしかしたら泳動サンプルに含まれる膜タンパク質量が少なすぎて 検出限界以下なのかもしれない。膜画分だけ採ってくると見えたりする。 変性させる時に高熱処理していれば、実はアグって泳動されていないかもしれない。 もちろん抗体の問題で、リコンビナントは認識したけど 細胞？から抽出した膜タンパク質は認識しない可能性もあります。 見たい膜タンパク質でウェスタンしている文献があれば、 抗体まで取り寄せてそのままやってみるのが一番はやい気がします。 同じエピトープで抗体作って、細胞から採った膜タンパク質のウェスタン検出で動いたという文献でもあれば良いですが、この分だと無さそうですし。

(無題) 削除/引用 No.2772-4 - 2009/02/01 (日) 09:33:31 - おお 修飾によるものが一つの説明だと思いますが、 エピトープが直接修飾されていなくても 近傍がにかなりかさばる糖鎖修飾とかあれば 抗体もアクセスしにくいと思います。 特にモノクロであれば高次構造を認識し ウエスタンで変性させたタンパクは検出できないか 検出感度が極端に弱いという抗体もしばし あります。 あと、膜タンパクでおもうのは、膜貫通部分は かなりのたんぱく質がへリックス構造をとり、 へリックス構造は抗体産生には向いていないので、 ペプチド抗体を作る時は避けることがおおいですね。 膜タンパクで抗体ができないということはそんなに 高い頻度かと言われると、そういう傾向はあるのかも しれませんが、世の中には膜タンパクに対する抗体も たくさんありますし、そんなにいつもそうだとは言えない と思います。 わたしなら、細胞内のドメイン中心にペプチドか リコンビナントを作って作るかなとおもいます。 細胞表面をファクスでラベルしたい時はべつですが、、

(無題) 削除/引用 No.2772-3 - 2009/02/01 (日) 01:51:28 - まりもこ りょうさん、ありがとうございます。 ひとつお詫びですが、私、ネイティブというのを、「非変性」という意味でなく、遺伝子を単離してきた元の生物種で発現している内在性タンパクという意味で使っていました。 おっしゃるとおり細胞外部分に対する抗体ですが、今ウェスタンブロッティングをやっていて、還元、変性させたタンパクを流しているはずなので、高次構造は崩れているはずと考えています。 糖鎖修飾を受けて、エピトープにアクセスできなくなっているというのはありそうですね。 ありがとうございました！

(無題) 削除/引用 No.2772-2 - 2009/02/01 (日) 01:20:34 - りょう 細胞外領域を抗原にした場合、nativeの物は糖鎖修飾など受けて、抗体がエピトープにアクセスできなくなる場合があると想像します。 あとは、接着分子やレセプターの細胞外部分は高次構造とってるでしょうから認識しにくくなるの場合もあるでしょう。 そう考えると短い細胞内部分は棒状など単純な高次構造をとっていそうで認識しやすそう。 でも穴あけ無用で使用できるFACS用の抗体は当然、細胞外部分に対する抗体だし、多数販売されていることを考えると、頑張れば？運が良ければ？幾らでも作成可能でしょう。 ポリクロなら抗体価あがるまで免疫繰り返すとか、モノクロならfusionの時のスケールを大きくして目的のクローンが得られる確率を上げるとか。

膜タンパク抗体が。。助けてください 削除/引用 No.2772-1 - 2009/02/01 (日) 00:16:49 - まりもこ 膜タンパクに対する抗体は、大腸菌で作らせたリコンビナントタンパク（これを抗原としてウサギに免疫し、得られた抗体です）を認識しても、ネイティブなタンパクは認識しないことが多い、という話を聞きました。 1)これは本当に、よくみられる現象なのでしょうか？ 2)その原因は何でしょうか？ 3)参考文献、論文などはありますか？ どれかひとつでもご存知の方、教えてください。

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