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(無題) 削除/引用 No.2761-6 - 2009/02/02 (月) 17:12:40 - ＩＲＥＳ >[Re:5] 免疫屋さんは書きました : > ボイルを長めに（15〜20分ほど）かければ粘性は消失します． > ターゲットの染色において，ボイル延長の弊害が出ないか否かを一応確認する必要があるとは思いますが． 私もこれでやっています。 それほどlysis bufferに対する細胞の比率を上げなければこれでさらさらになりますね。弊害は今のところ経験していませんが、ないとは言い切れませんね。

(無題) 削除/引用 No.2761-5 - 2009/01/30 (金) 15:54:44 - 免疫屋 細胞溶解の際にSDS-sample bufferをどうしても使用しなければいけないというのであれば… ボイルを長めに（15〜20分ほど）かければ粘性は消失します． ターゲットの染色において，ボイル延長の弊害が出ないか否かを一応確認する必要があるとは思いますが．

(無題) 削除/引用 No.2761-4 - 2009/01/30 (金) 11:14:20 - ats benzonaseをSDS-sample bufferに1/10000-1/1000 vol加えるのが楽です。 室温数分でサラサラになります。 ただしwestern blotでは不純物による予期しないバンドがでる可能性がありますから(もっともこれまでその経験はありませんが）、必ずNegative controlを取ってください。

(無題) 削除/引用 No.2761-3 - 2009/01/30 (金) 02:26:51 - おお 洗って使うのは可能でしょうけど、DNAが溶け出てくるくらい 強いコンディションが必要でしょうか。 もう少しマイルドな核マトリクス、染色体が溶液中にでてこない ぐらいの可溶化のコンディションで溶出するならそういうバッファー を使えばいいかと思ったのですが。 簡単に洗うなら水でニードルごとすって、押し出すのを数回やれば たいていの場合希釈倍率からして十分です。 水の代わりにSDSやウレアなどの溶液を使うと洗浄力はあがります。 洗剤は使うと、洗剤を切るのが大変でしょうし、てまかもしれません。 ただし、感度、発現変動のレンジによっては若干危険がともなるかもしれません。 タイムコースなら、とのタイムポイントでどのシリンジをつかうか 決めておくと、トラブルが少ないとは思いますが、、、、 ウレアを使って細胞を溶解してもサンプルバッファーと同じように DNAは溶け出てきます。

(無題) 削除/引用 No.2761-2 - 2009/01/30 (金) 01:12:24 - A 最近何処かで書きましたがWBかなにかで発現しているかどうかを見たい だけなら8M Urea+1xPBSでwhole lysateを抽出してSDS-PAGEするのは 如何ですか？この場合抽出したサンプルと4xSBを混ぜるわけですが エピトープが変わってしまうので煮沸処理はしないでそのままゲルに のせてください。

SDS-sample bufferの時のDNAを切る際に 削除/引用 No.2761-1 - 2009/01/29 (木) 22:52:00 - 教えてください。 こんばんは。 これから多くのサンプルを回収してSDS-PAGEを行おうとしています。 細胞はSDS-sample bufferでlysisして、DNAをズタズタに切ってSDS-PAGEに用いなければなりません。 ただ、sonicatorがないため、注射器にlysateを吸ったり出したりしてDNAを切りたいと思っています。 しかし、問題はサンプル数が多いため、注射器と針を大量に消費してしまいます。 エコロジストの僕としてはできれば、使い回ししたいと思っています。 みなさんはどう思いますか？使い回しは可能でしょうか？ 可能であれば、どのように洗っていますか？ 大量といってもtime courseを取るだけなのでせいぜい8サンプル程度ですが、再現性とったりすると半端ないので… あるいはもっと簡便に寸断できるという方法があれば教えてください。 よろしくお願いします。

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