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(無題) 削除/引用 No.2759-8 - 2009/01/30 (金) 11:21:06 - AP >どの辺から波形が取れるかは、使っているプライマーの長さによると思いますが、長いほどプライマーに近い配列が取れるはずです。 逆に、PCRプライマーが30 ntくらいだとして、シークエンス用に端から15 ntくらいのプライマーを使えば、より端のほうから読めますね（プラスミドベクターのユニバーサルプライマーもそれくらいの長さだし）。PCRプライマーの配列は決まっているのでその部分は読めなくてもかまわないはずだし。 まあ、そのためにプライマーを別に作るというひとはいなさそうですが。

(無題) 削除/引用 No.2759-7 - 2009/01/30 (金) 11:03:55 - おお >[Re:5] takaさんは書きました : > おお様 > ＞Really...... > 「だよねー」と理解していいのでしょうか。レアリ−？だと全然意味が違っちゃいますけど。使い方の難しい単語ですね（笑。 > 患者さんのDNAからPCRし、得られたフラグメントを 直接シーケンスすることがあります。できれいに読めると 一方のアレルの配列が他方と違った時その部分だけ2種類の 塩基が現れるわけです。そういう図はバプリッシュされています。 長さ的にはエクソン領域に設定することが結構ありますので そのエクソンのイントロン領域の配列から、エクソン部分を よむとか結構あると思います。なので100から500bpくらいかな。 プライマーに近いところが読めないことを考慮してイントロン の配列で余裕を持たせてというのが普通です。 今回80bpとちょっと短いですね。ですから綺麗にフリーのダイを ぬくとか慎重にやらないと直接だとうまく読めなくなってしまいます。 基本時にシグナルは１塩基目(プライマーに１塩基付加されたもの) から出てきます。ヘタにゲル濾過/エタチンとかで短いところをロスったり しない限り。 ただマトリクスではうまく処理し切れずコンピューター上では最初の何ベース かはNの表示になってしまうと思います。ただ波形をおうと 可也読めますので、裏と表両方読んでコンファームすれば いいかと思います。 キャピラリーも1kb弱読めるものから、短くて比較的短距離 に向いているものと種類がありますので、一番短いやつ( 今何種類あるか分かりませんが)でやると、最初の方も クリアーに出てきます。 これはABIのシーケンサーの経験上の感想です。ベックマンだと どうか分かりません。

(無題) 削除/引用 No.2759-6 - 2009/01/30 (金) 11:01:14 - 中年 まずはPCRの時と同じプライマーを一つずつ使ってそのままシークエンスしてみたらどうですか？シークエンス反応後の精製法によっては、プライマーの下流15bpくらいから読める場合もあるので、両側から読めば全長カバーできるのでは？

ありがとうございます 削除/引用 No.2759-5 - 2009/01/30 (金) 09:50:34 - taka AP様 ＞長いほどプライマーに近い配列が取れるはずです。 ＞ABIのBigDyeの場合、ver 1.1のほうがプライマーに近い方まで読めます いろいろ参考になる情報をありがとうございます。今回はサブクロしてからシークエンスにしようとおもいます。ありがとうございました。 とも様 サブクロしてシークエンスすることにしました。コメントありがとうございました。 おお様 ＞Really...... 「だよねー」と理解していいのでしょうか。レアリ−？だと全然意味が違っちゃいますけど。使い方の難しい単語ですね（笑。

(無題) 削除/引用 No.2759-4 - 2009/01/30 (金) 04:10:54 - おお >[Re:3] ともさんは書きました : > サブクローニングしてシークエンスが普通ですよ。 Really......

(無題) 削除/引用 No.2759-3 - 2009/01/29 (木) 18:41:26 - とも サブクローニングしてシークエンスが普通ですよ。

(無題) 削除/引用 No.2759-2 - 2009/01/29 (木) 18:18:46 - AP 蛍光シークエンサーだとプライマー近くがかなりの範囲読めませんけれど、両方向からシークエンスすればダイレクトシークエンスでカバーできるでしょう。 どの辺から波形が取れるかは、使っているプライマーの長さによると思いますが、長いほどプライマーに近い配列が取れるはずです。 ABIのBigDyeの場合、ver 1.1のほうがプライマーに近い方まで読めます（ver 3.1は長距離にわたって安定した波形がでるけれど、プライマー付近は苦手）。 スラブゲル、RIのサンガー法ではプライマー直後、1,2 塩基から読めたりしたものですが。

短いPCR産物（80bpくらい）の塩基配列決定 削除/引用 No.2759-1 - 2009/01/29 (木) 18:03:26 - taka 適当なベクターにサブクローニングして塩基配列決定するのが無難でしょうか？

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