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ありがとうございます。 削除/引用 No.2748-5 - 2009/01/29 (木) 08:53:56 - タカ 返答ありがとうございます。 ＞おお先生 一応ネガコン（transfection試薬のみ）は動かないのでOKです。 ＞MP先生 付着細胞ですが、最終的にはPBSで洗って、 張り付いたそのままRIPAバッファーで洗浄しています。 あと、 ＞マスターベー先生 無血清培地になると、その付着細胞ははがれやすいようです。 はっきりいうとHEKです。 とにかくMAPKは動きやすい、ときうことでしょうか？？？

(無題) 削除/引用 No.2748-4 - 2009/01/28 (水) 17:20:59 - MP お使いになっているのは付着系細胞ですか？ 付着系細胞のMAPKの動きを見る際は、細胞の回収時に注意が必要です。 細胞をメカニカルに剥がすと、それがストレスになりそれだけでMAPKが強く動きます。 そのあたりは大丈夫でしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2748-3 - 2009/01/28 (水) 14:29:58 - マスターベー（略 24hrは多くの場合、標準的な条件だと思いますが、血清入りの培地を吸ってPBSで洗い、無血清の培地を入れるという操作だけでは不十分な場合もあります。トリプシンで剥がして無血清の培地にまき直すとか。

(無題) 削除/引用 No.2748-2 - 2009/01/28 (水) 14:03:44 - おお トランスフェクションしたものがMAPKカスケードを動かしている 可能性も考えてみてください。 それともコントロールをとってそれも動いているということでしょうか。 deathシグナルでMAPKが動いている可能性はじゅうぶん考えられます。

スタベーションはどのくらい必要？ 削除/引用 No.2748-1 - 2009/01/28 (水) 13:32:48 - タカ ある細胞にプラスミドをtransfectionして、 試薬をかけた時のMAPKの動きをみようと思っています。 試薬をかけてからリン酸化が増加するまでの時間経過はある程度わかっており、 プラスミド毎の差を出したいのが目的です。 transfectionの際には血清がないと細胞が死にますから、 transfectionして、一定時間(12hr)後からserum　starvationを置き、 その上で試薬をかけて実験しています。 ところが、transfectionした細胞はことごとく MAPKのリン酸化が動いており、 starvation（24hr)が不足したのかどうか考えあぐねています。 starvationによって、deathシグナルでMAPKが動いている、 などのように考えられるでしょうか？ 一般にstarvationは細胞によって異なると思いますが、 どのくらいあればFCSの刺激は消失すると考えられますか？

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