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(無題) 削除/引用 No.2747-19 - 2009/01/31 (土) 17:47:15 - おお >[Re:18] 凍結融解さんは書きました : > 凍結融解はなぜいけないのでしょうか？ > > 教科書的にはタンパクの変性、失活を引き起こすとのことですし > 例えば抗体、酵素の類いで凍結融解による失活は経験しています。 いけないというか、そういう例があるなら折角活性があるタンパクを 合成しているのに凍結で失活させている可能性もあるので 凍らしたくないというのがほんとのところではないでしょうか。 凍結させて、得られたタンパクが凍結のために活性がなくて、 それに気付かず培養条件ばかりいじっているとしたら目も充てられません。 > > ただ一方で、他のタンパク質では一般的にそれほど注意が促されない気がします。 > 実際、細胞からのタンパク抽出に使われていますし > （ただこの場合はWBがメインだからでしょうか？） 細胞からライセートをとって凍結して保存ということは 当たり前のようにしてますね。凍結しない場合とで タンパク同士の相互作用がなくなっていたりなんて考えると IP用サンプルも凍結できないわけですが、、、、、 よく考えないとダメということなのかなぁ。 > また凍結融解によって影響を受けやすい、受けにくいタンパク質などの傾向が > あったりするのでしょうか？ なるほど、、、そういう話はあまり聞いたことがないですね。 どなたかセオリーを持っていたら書き込んでほしいですね。 > > そもそも変性とは？完全長で精製された物は安全？ > 等、色々疑問があります。 もう少し具体的に書いてみてはどうでしょうか。 > > もしこのトピに不適切でしたら改めたいと思います。 > 自由に議論ができればと思いますので、大丈夫です。 以前も私のとピでどんどん話がそれていったことがあります。

(無題) 削除/引用 No.2747-18 - 2009/01/31 (土) 14:57:52 - 凍結融解 横やり、勉強不足で恐縮ですが 凍結融解はなぜいけないのでしょうか？ 教科書的にはタンパクの変性、失活を引き起こすとのことですし 例えば抗体、酵素の類いで凍結融解による失活は経験しています。 ただ一方で、他のタンパク質では一般的にそれほど注意が促されない気がします。 実際、細胞からのタンパク抽出に使われていますし （ただこの場合はWBがメインだからでしょうか？） やはりどのタンパク質も注意すべき事なのでしょうか？ また凍結融解によって影響を受けやすい、受けにくいタンパク質などの傾向が あったりするのでしょうか？ そもそも変性とは？完全長で精製された物は安全？ 等、色々疑問があります。 もしこのトピに不適切でしたら改めたいと思います。 宜しくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.2747-17 - 2009/01/31 (土) 14:26:56 - おお >[Re:16] EcoRIさんは書きました : > そんなにキツイ濃度を入れる訳じゃないですから(せいぜい0.1%以下かなぁ) > ダメージは少ないとみていいんじゃないでしょうか？ 楽観的に考えるとま、そうですね。 でもいつもそうかというと自身がないわけです。 入れないで十分可溶性があるものにわざわざ加えるというのも なんかちょっと何やってんのみたいなところもありますし。 低い濃度のTRITONを使って溶出して(といってもTRITONX100は 0.1%ですでにCMCをこえているので膜を可溶化する能力 をもっていますが)、必要ないから精製の過程で抜くというのも 勇気が入ります。カラムにかけているとき置換するにしても あぐらないかとか、、、それと一度加えると簡単に抜けるもの ではありませんし。 あとはアッセイ系が他のタンパクが含まれていて、それが 界面活性剤OUTだと、抜くか、最初から使わないかということ になります。 やってみないと分からないからま、あまり議論するところでも なさそうですね、、、、、 振っておいてすいません。

(無題) 削除/引用 No.2747-16 - 2009/01/30 (金) 13:55:58 - EcoRI 違う違う Lysis時にdetergentを入れることで、目的のタンパクが失活してしまうことを 懸念されてるわけだから… そんなにキツイ濃度を入れる訳じゃないですから(せいぜい0.1%以下かなぁ) ダメージは少ないとみていいんじゃないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2747-15 - 2009/01/30 (金) 13:40:45 - EcoRI >TRITONをデフォルトと言う事ですが、デタージェントが気になることは APさんじゃなくて、恐縮ですが… 大腸菌のlysateをそのままアッセイにもっていくことってあるんでしょうか？ 硫安沈殿なり、カラムなり、なんらかの精製を踏むことと思います。 もって行く場合にも、なんらかのコントロールを取りますよね。 ですので、Lysisの時に入ってるデタージェントは問題にならないと考えます。 あぁ、そうか、酵素活性があるかどうかを見るなら、lysateをそのままもっていくか… うーん…

(無題) 削除/引用 No.2747-14 - 2009/01/30 (金) 13:03:49 - おお >[Re:13] APさんは書きました : > > それやこれやで、lysozymeとTriton-Xで溶菌してゲノムを壊すためのDNaseを加える方法をデフォにしています。 > なるほど、凍結や超音波は結構最適な条件を見つけるのが大変そうです。 TRITONをデフォルトと言う事ですが、デタージェントが気になることは ないでしょうか? ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2747-13 - 2009/01/30 (金) 11:38:33 - AP 大腸菌を直接サンプルバッファーで溶菌した場合と、ソニケーションでlysateにしたものとでSDS-PAGEでみると、後者のほうがあきらかにのサイズが小さくなる融合タンパク質が、以前扱ったなかにありました。超音波による物理的剪断のようです。 また、完全に溶菌するのに必要最小限のソニケーションの加減が難しくて、溶菌し残って収量を損することもたびたび。 凍結融解は、溶菌されない菌が結構残った印象です。 それやこれやで、lysozymeとTriton-Xで溶菌してゲノムを壊すためのDNaseを加える方法をデフォにしています。

(無題) 削除/引用 No.2747-12 - 2009/01/29 (木) 05:45:01 - おお >[Re:10] EcoRIさんは書きました : > GEによれば、凍結融解は > >非常に簡便な操作でタンパク質を抽出できます。失活をともなうことが多く、タンパク質の活性が重要な実験ではあまり用いられません。 > (タンパク質の抽出・細胞破砕法から抜粋) > ということなので、本当にタンパク質によりけりなんでしょうね。 なるほど。精製した売っている酵素とかでも 凍結はダメでというものがあります。 そう考えると凍結は確信がない限り避けた方が いいですね。 参考になりました。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.2747-11 - 2009/01/28 (水) 21:43:36 - A >[Re:10] EcoRIさんは書きました : > GEによれば、凍結融解は > >非常に簡便な操作でタンパク質を抽出できます。失活をともなうことが多く、タンパク質の活性が重要な実験ではあまり用いられません。 > (タンパク質の抽出・細胞破砕法から抜粋) > ということなので、本当にタンパク質によりけりなんでしょうね。 そうですか。今まで問題になったことが無かったので私は凍結融解は結構 マイルドな方法かと思っていたのですがどうやらそうではないようですね。 情報ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2747-10 - 2009/01/28 (水) 20:32:51 - EcoRI GEによれば、凍結融解は >非常に簡便な操作でタンパク質を抽出できます。失活をともなうことが多く、タンパク質の活性が重要な実験ではあまり用いられません。 (タンパク質の抽出・細胞破砕法から抜粋) ということなので、本当にタンパク質によりけりなんでしょうね。

(無題) 削除/引用 No.2747-9 - 2009/01/28 (水) 17:35:02 - A 以前の研究室ではソニケーション、現在の研究室では凍結融解と フレンチプレスを使ったことがあります。現在の研究室の同僚が 同じ菌体を使って凍結融解とフレンチプレスでの可溶化の効率を 比べたそうですがその場合は凍結融解の方が効率が良かったそう です。話からしてマイルドな条件で目的タンパク質を抽出したいと いうことかと思います。念のため今の研究室で標準になっている 凍結融解による抽出プロトコールを示しますので良かったら参考に してください。 １．菌体を1xPBSで溶く（1Lの菌体で13mL）。 ２．細胞壁を除くためにリゾチームを加え（最終濃度300ug/mL）氷上で１時間。 ３．液体窒素と37度の恒温相を使い凍結融解を4回繰り返す。 ４．DNaseIを加え（400U）氷上に1時間置き抽出されたDNAを分解。 ５．DNAを含むゲル状の溶液がさらさら流れる溶液になったことを確認して、4度、12,000rpmで30分遠心して上清を回収。 これで幾つかのタンパク質の抽出を行った経験がありますが抽出 効率で問題になったことはありません。 フレンチプレスの件ですがフレンチプレスに限らずソニケーション やガラスビーズを含めて物理的な破砕は熱の発生を伴いますから 話に出てくる可溶画分に来る一定の構造を取らないでからまって いるようなタンパクは部分的に熱変性しているのかもしれません。 そのような危険性を避けるには時間はかかりますが凍結融解が 安全かと思います。

(無題) 削除/引用 No.2747-8 - 2009/01/28 (水) 15:47:44 - あるば 量が取れなくても良いということであれば、凍結融解かリゾチーム処理がマイルドでよさそうな気がします。 リフォールディングについては、超音波だとウレアに溶かしてリフォールディングしたら溶ける（活性などは測定せず、取りあえず溶ける）けど、フレンチプレスだとリフォールディング操作で何度やっても析出してしまうという状況になったことはあります。 これは色々あってやめてしまったので大した参考にはなりませんが、こんなのもあったよということで。

(無題) 削除/引用 No.2747-7 - 2009/01/28 (水) 14:38:46 - おお >[Re:6] 中年さんは書きました : > > 可溶性画分に来る程度には小さいけどきちんとフォルディングしていないようなアグリゲーション状態のものが取れてきているんだろうなと思っていました。菌体からのタンパク質の抽出法に依存した現象ではありませんでした（凍結融解、ソニケーション、B-PERのような複合ディタージェント系の溶出試薬で差無し）。 うーんなるほど、、、そうなった場合はガーンと変性させて うんよくうまくリフォールディングする夢でも見た方が いいのかな。 タンパク自身の性質にもよるのでしょうね。 難しいもんです。 再度、詳細な説明ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2747-6 - 2009/01/28 (水) 14:26:39 - 中年 ご質問の意味を読み誤っていました。私が半端なアグリゲーションと言ったのは、フレンチプレスに限ることではありません。 発現したけどほとんど不溶性だったというようなタンパク質を、発現条件をいじってなんとか半分くらいは可溶性に来るようになった、というようなケースのいくつかで、ひとまず精製はできるのに取れてきたタンパク質が、レジンから溶出できないとか、できても比活性が低いとか、置いておくとチューブに吸着して出てこないとか。これはきっと、可溶性画分に来る程度には小さいけどきちんとフォルディングしていないようなアグリゲーション状態のものが取れてきているんだろうなと思っていました。菌体からのタンパク質の抽出法に依存した現象ではありませんでした（凍結融解、ソニケーション、B-PERのような複合ディタージェント系の溶出試薬で差無し）。

(無題) 削除/引用 No.2747-5 - 2009/01/28 (水) 14:13:36 - おお >[Re:4] EcoRIさんは書きました : > 大腸菌ゲノムの破断を目的にソニケーションすることもあります。 はい、ありがとうございます。 これは残念ながらしっておりました。 > > 凍結融解で完全に溶出できるかどうかはわかりませんが、 > プラクティカルには凍結融解で菌体が壊れているなら、 > >完全に可溶性で、大腸菌内のたんぱく質と相互作用をしていないたんぱく質 > は溶出ができていると判断できるのではないでしょうか？ > 菌体が壊れているか、というのは検鏡すればわかりますし。 > タンパクが出てくるぐらいじゅうぶん壊れているだろう という判断ということですね。 イーストは難しいですから、溶出は。 あ、けん鏡してどれくらい壊れてるかみると、 実感がつかめますね。 バクテリアみる顕微鏡、、、マンマルにつかってる ものばかりだからコンタミすると怒られるだろうな、、、 、、、うーんむずかしいな。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2747-4 - 2009/01/28 (水) 14:04:38 - EcoRI 大腸菌ゲノムの破断を目的にソニケーションすることもあります。 以前、菌のペレットにサンプルバッファーを入れて、熱処理だけをしたものをPAGEにかけると、 DNAらしきものが濃縮ゲルにスタックしたあげく、泳動像がメチャクチャになりました。 あとゲノムのねばねばがなくなるので、液のハンドリング性も向上します。 凍結融解で完全に溶出できるかどうかはわかりませんが、 プラクティカルには凍結融解で菌体が壊れているなら、 >完全に可溶性で、大腸菌内のたんぱく質と相互作用をしていないたんぱく質 は溶出ができていると判断できるのではないでしょうか？ 菌体が壊れているか、というのは検鏡すればわかりますし。 フレンチプレスは使ったことが無いので、言及できません。

(無題) 削除/引用 No.2747-3 - 2009/01/28 (水) 13:54:51 - おお >[Re:2] 中年さんは書きました : > 後半の事例は良くあることだと思います。インクルージョン・ボディを削っているのかどうかはともかく、きちんとした構造を取ったモノマーではなく、かといって超遠心でも沈殿しないようなアグリゲーションという意味なら。 やはりそうなんですね。周りの実験とかみていると、それなりにタンパクが取れているけど 挙動がどうもおかしく、そこで今度自分の実験をするときはフレンチプレスをやめて、 量が取れなくても、大腸菌内の可溶画分にあるたんぱく質だけ取ってこようと考えると 前半のようなアプローチになるかなあと考えをめぐらせているわけです。 しかしフレンチプレスを愛用されている方々はそういう問題も 何らかの方法で乗り越えてるのではとも考えたりもします。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2747-2 - 2009/01/28 (水) 13:42:08 - 中年 凍結融解で溶菌しているならそれで十分だと思います。ソニケーションは溶菌のために凍結融解の代わりに使うものだと思います。 後半の事例は良くあることだと思います。インクルージョン・ボディを削っているのかどうかはともかく、きちんとした構造を取ったモノマーではなく、かといって超遠心でも沈殿しないようなアグリゲーションという意味なら。

大腸菌から、リコンビナントの溶出 削除/引用 No.2747-1 - 2009/01/28 (水) 12:29:41 - おお 例えば、完全に可溶性で、大腸菌内のたんぱく質と相互作用を していないたんぱく質は、凍結融解で完全に溶出できるで しょうか。そうでない場合それより若干強い溶出法として 次に選択する方法を考えるとしたら何でしょうか。 グラスビーズ、弱いソ二ケーションとかでしょうか、、 いっぱいとぴを立てるのは(というかもうすでに複数ですが) どうかと思いますので、違う質問もついでに。 フレンチプレスで抽出したばあい、起こりがちなトラブルに ついてうかがいたいと思ってます。 どうも30000gくらいで遠心してもアグリゲーションをおこしている のではないかという挙動をしめすタンパクがあるような気がします。 なんか、インクルージョンボディーを削って数分子のポリペプチドが たんに一定の構造を取らないでからまっているようなタンパクが 可溶画分に来ているのではという気がすることがしばしあります。 みなさまはそう感じたことはないでしょうか。 (現在の具体的な実験の相談でありませんので 実験に関しては詳しくかけません。 周りの人のデーターや自分の過去の経験などの 感触ということで、ご理解願います)

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