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PCR産物の精製 トピック削除
No.2743-TOPIC - 2009/01/27 (火) 20:30:16 - ぽん
質問させてください。

私たちの研究室ではこれまでPCRにPCR産物の末端にAの付加されるポリメラーゼを使用していましたが、最近エラーが気になりKODなどのAの付加されないタイプのポリメラーゼを使用するようになりました。
PCR後にTAクローニングをするため、Aを付加しないといけないのですが、そのためにPCR産物をKitで精製し、それを以前使用していたポリメラーゼ（A付加タイプ）で72℃で処理してA付加を行い、再度Kitで精製し、TAクローニングを行うという操作をしています。しかし、精製Kitの使用量が大幅に増えたため、1度目のPCR後の精製をエタ沈に変えることは出来ないだろうかと考えています。
ためしにエタ沈精製を行い、TAクローニングを行いましたが、効率が大きく下がってしまいました。

最初のPCRで使用したポリメラーゼやプライマーの混入などの心配もあるため、悩んでいます。

ご意見をよろしくお願いします。
　
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(無題) 削除/引用
No.2743-10 - 2009/02/09 (月) 15:35:07 - nn
リン酸化したプライマーを用いてPCRすれば
Aが付加されるのでKODを使っても、そのまま
TAクローニングできるのではないでしょうか。
間違ってたらごめんなさい。

(無題) 削除/引用
No.2743-9 - 2009/01/28 (水) 12:24:41 - せぴー
経験談ですが、KODでPCRしたものをTAクローニングしたら、
綺麗にクローニング出来たことがありました。。。
聞き流してください。。。

(無題) 削除/引用
No.2743-8 - 2009/01/28 (水) 00:07:18 - パンタ
ecoさん、APさん、ありがとうございます

＞blunt endと、例え一塩基でも付着末端があるのとではligation効率が一桁くらい違うんじゃないですか

そんなに違うんですか！？　ちょっとあなどってました。

＞PCR産物のリン酸化とA付加では、A付加のほうがなんぼか楽でしょう

私はプライマーをリン酸化してしまうので、PCR後の精製の回数で平滑に軍配（？）
あ、でもA付加の後、精製なしでもイケると、、引き分けですね

＞T-vectorが常備されているなら、ベクターの準備が必要ないですね

＞制限酵素できる手間が省けることじゃないですか？

全く、おっしゃるとおりです。
しかもこのT-Vector、うちではPromegaのを使ってるんですが、これが1/10くらいに希釈してもばっちり生える優れもの、コスト的にも問題なし！

PCR産物が長い時、試してみようかな。。。

(無題) 削除/引用
No.2743-7 - 2009/01/27 (火) 23:42:30 - AP
・blunt endと、例え一塩基でも付着末端があるのとではligation効率が一桁くらい違うんじゃないですか。
・PCR産物のリン酸化とA付加では、A付加のほうがなんぼか楽でしょう。
・T-vectorが常備されているなら、ベクターの準備が必要ないですね。

(無題) 削除/引用
No.2743-6 - 2009/01/27 (火) 23:29:02 - eco
TAクローニングする理由は制限酵素できる手間が省けることじゃないですか？

横から失礼します 削除/引用
No.2743-5 - 2009/01/27 (火) 22:36:54 - パンタ
平滑のPCR産物にわざわざAを付加してTAクローニングするくらいなら、SmaIとかEcoRVで切ったベクターに入れちゃえ、と日頃から思っているんですが、TAクローニングでしかできないことや、強みなんかがあるんでしょうか？
思いつくのは、
１．PCR産物側をリン酸化する必要がない
２．ligation時間が短くてもいい（？）
３．大きい断片が入りやすい（？）
くらいです。

ご回答、お願いします

(無題) 削除/引用
No.2743-4 - 2009/01/27 (火) 21:43:01 - AP
>どちらかと言えば２度目の方の精製を省けると思います。

これも、もっともです。二度目の反応でA付加をしたら、そのままligationに持っていくこともできますね。非特異的産物を除く必要があるなら、最初の反応の後にやって、そこで精製にキットを使えばいいでしょう。

(無題) 削除/引用
No.2743-3 - 2009/01/27 (火) 21:33:15 - AP
>１度目の精製をEtOH沈殿にするなら、その前に十分にフェノール抽出を行うべきでしょう。

賛成です。基本ですね。

各社がカタログなどに酵素の失活条件（熱処理、EtOH ppt、フェノール抽出）を載せているでしょう。耐熱性polの失活条件を明記している資料があまりないですが、私が見つけたのでは（フェルメンタスだったか）フェノール抽出になっています（耐熱性ではないT4 polですらそう）。proof-reading活性のpolが残存すると、dNTPがたっぷり加えられても3'突出末端は削られてしまうでしょう。

　

(無題) 削除/引用
No.2743-2 - 2009/01/27 (火) 21:16:15 - 中年
どちらかと言えば２度目の方の精製を省けると思います。ヌクレオチドの濃度が低い状態で酵素活性が残っていることは避けたいので、１度目の精製をEtOH沈殿にするなら、その前に十分にフェノール抽出を行うべきでしょう。

PCR産物の精製 削除/引用
No.2743-1 - 2009/01/27 (火) 20:30:16 - ぽん
質問させてください。

私たちの研究室ではこれまでPCRにPCR産物の末端にAの付加されるポリメラーゼを使用していましたが、最近エラーが気になりKODなどのAの付加されないタイプのポリメラーゼを使用するようになりました。
PCR後にTAクローニングをするため、Aを付加しないといけないのですが、そのためにPCR産物をKitで精製し、それを以前使用していたポリメラーゼ（A付加タイプ）で72℃で処理してA付加を行い、再度Kitで精製し、TAクローニングを行うという操作をしています。しかし、精製Kitの使用量が大幅に増えたため、1度目のPCR後の精製をエタ沈に変えることは出来ないだろうかと考えています。
ためしにエタ沈精製を行い、TAクローニングを行いましたが、効率が大きく下がってしまいました。

最初のPCRで使用したポリメラーゼやプライマーの混入などの心配もあるため、悩んでいます。

ご意見をよろしくお願いします。
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