全25件 ( 21 〜 25 )　 前 | 次 　1/ 1. 2. /2

(無題) 削除/引用 No.2738-5 - 2009/01/27 (火) 13:09:24 - おお ミオシンがCBBではっきりとした太いバンドがでてないと、 タンパクが完全に溶出していると言いがたいですね。 膜タンパクとかであればそれでもいい(むしろその方が 目的のたんぱく質が多く含む)かもしれません。 SDSサンプルバッファーをPBP(青い色素)なしでつくって ライセートを作ってみてはどうでしょうか? 濃度にもよりますけどブラッドフォードでSDS許容範囲 以下の濃度にまで下げてタンパクを定量することが できますし。SDSは必ずしもオリジナルサンプルバッファー の濃度が必要ということでもないので、若干さげても いいかもしれません。 あとRIPAでライセートを作った時、不溶な画分が 見られましたか(遠心などで取り除くとおもいますが)? そういうフラクションは念のためSDSサンプルバッファー を加え同時に流すようにした方がいいですよ。 溶出し切れずに、そういうフラクションに行っている 場合がありますし。それで検出されたら、次に方針が 立つと思いますし、あるいはそのままデーターとして 使っても良い場合もあるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2738-4 - 2009/01/27 (火) 12:37:19 - 名無し 技術的な問題は別にして、まずWBで調べたい蛋白質は何ですか。脊髄と骨格筋は別々の組織なので脊髄にたくさんあっても骨格筋には少ないということは不思議ではないとおもいます。特にもし神経の機能と関わりがある蛋白質ならば十分考えられることと思います。 またβアクチンを指標にされているようですが、βアクチンは骨格筋にそんなにたくさん含まれているのでしょうか。この辺は専門でないのであくまで学校の生物学で習った範囲の知識（いま時間がなくて改めて確認していないのでもし誤認であればすみません。）ですが骨格筋はαアクチンが主であり、それに対してその他の非筋肉細胞は一般にβアクチンとγアクチンが主でこれらがマイクロフィラメントを構成していると習ったような気がします。

ありがとうございます． 削除/引用 No.2738-3 - 2009/01/27 (火) 12:13:05 - タンパック 蛋白量は20と40ugで行いました．（脊髄ではこの量でバンド検出できたため） gelのCCB染色はしたのですが，200kD付近には特に何もみえていません． ホモジナイズの方法ですが，-80℃に凍結されている切片（未固定）をホモジナイザーに入れて10回ほどlysis bufferの中でホモジナイズしています． ネットでみつけた他人のプロトコール上ではエレクトロニックホモジナイザーを使っている人もいるようですがそこまでするべきでしょうか？（ちなみに持っておりません．ソニケイドはあります） また，protease inhibitorはカクテルのを使っているのですがPMSFなどは含まれていなく加えた方がいいのかな〜と思っております． いずれにせよ，私のやり方ではb-actinも検出されないので何かに決定的問題があるのではと思っております． その他，b-MEをサンプルバッファーに入れて煮沸する際にいれているのですが，これもホモジナイズの時のlysis bufferに加えた方がよいのでしょうか？ このサイトがゆういつの頼りです．よろしくお願いします．

タンパク量 削除/引用 No.2738-2 - 2009/01/27 (火) 10:32:21 - GLUT4 タンパク量はどのくらい載せましたか？ 転写後のメンブレンをCBB染色してみてはどうでしょうか。 骨格筋だと200KDa付近にミオシンの太いバンドが見えるはずです。 それが見えなければホモジナイズがうまくいっていないのだと思います。

WBにおけるホモジナイズなど 削除/引用 No.2738-1 - 2009/01/27 (火) 07:58:31 - タンパック 今までマウス脊髄組織のウエスタンブロットを行っていて特に問題なくできていたのですが、同じ方法でマウスの筋肉（frozen）でトライしましたら、蛋白のバンドが見えなくなってしまいました。 stripping後、b-actinの抗体でも試したのですがこちらもだめでした。（50kDのところにIgGと思われるバンドはみられます→転写は問題ない） lysis bufferにはRIPAを用いProtease inhibitor cocktailも使用しています。 同じ蛋白をみようとして筋肉だけでみられないということは、ホモジナイズの方法に問題があるのかなと考えています。 マウス筋肉でのWBのご経験のある方またはない方でもご意見アドバイスをいただけると助かります。

全25件 ( 21 〜 25 )　 前 | 次 　1/ 1. 2. /2

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---