全14件 ( 1 〜 14 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.2737-14 - 2009/01/28 (水) 13:52:51 - ザンギ 予想が外れましたね。 PCRのかからない鋳型とプライマーの組み合わせではシーケンスも読めない と思いますよ。 2セットのプライマーを持ってらっしゃるようですが、nested PCRもかから ないんでしょうか？ 僕もきれいなバンドのようでも、末端までちゃんと2本鎖になってるかは はっきりとは判らないものです。 APさんの削れ込み説も含めて、1回目のPCR条件とか精製も要検討かと。

(無題) 削除/引用 No.2737-13 - 2009/01/28 (水) 13:46:55 - AP あ、最初の質問文で精製してもだめ、とありましたね。 でも、サイクル終了後、速やかににやっているのかな。 ある程度保持した産物で2ndをやってうまくいかなかったから、同じ1st PCRを精製した物でやり直した、ということではないですよね。

(無題) 削除/引用 No.2737-12 - 2009/01/28 (水) 13:35:48 - 中年 似た経験をしたことがあります。 PCRのエラーを利用してDNAにランダムに変異を導入しようとしたときに、変異率を変えた一連の標品を作ろうとして、最初のPCR産物の1/100を2度目のPCRの鋳型に、2度目のPCR産物の1/100を3度目のPCRの鋳型に用いたことがあります。そうすると、1度目ではっきりしていたバンドが、2度目、3度目と薄くなり、バックにスメアが出るようになりました。その時は、PCR反応の副産物（PPiや酸化したdNTPなど？）が溜まって邪魔をしているのかなと勝手に納得していました。 でも、ポスドクなのに・・・・・さんの場合は、PCR産物をキットで精製して次の反応に加えておられるので、この説明は成り立ちませんね。私もまた気になってきました。

(無題) 削除/引用 No.2737-11 - 2009/01/28 (水) 13:31:53 - AP はじめに書いた >3' exonuclease活性のある酵素だと、適切な精製をしていないと末端が削れこみを起こして、 という点は、クリアしているんでしょうか。 これが原因だとしたら、シークエンスが取れないに3000点。

ありがとうございました 削除/引用 No.2737-10 - 2009/01/28 (水) 12:48:33 - トピ主です。 ご回答いただきました皆様、本当にありがとうございました。 拙い文章により伝わらなかった点が多々あったかと思いますので もう少し説明させてください。 あるば様のおっしゃる通り、サイクル数を増やせば当然変異が入る可能性も増える訳で 幸い１回目のＰＣＲによライゲーションに十分な量の産物が得られておりますので 表題の「２回目のＰＣＲ」は本来必要はないのです。 そのことは十分存じ上げているつもりです。 ただ、結果的にその産物を用いたトラフォメがうまくいっておらず、 正しい配列を持っていれば理論的に２回目のＰＣＲでも増幅されるはずであることから 「インサート調製にすべての問題がある」と表現した次第です。 つまり「どうしてもＰＣＲによりインサートを調製したい」という意味ではなく 「２回目のＰＣＲが問題なくかかるような正しい配列のインサートを調製したい」という意味で書いたつもりでした。 紛らわしい表現で大変失礼致しました。 私が一番お伺いしたかったのは「１回目のＰＣＲで問題なく増えた産物をテンプレートにして２回目のＰＣＲをした際にまったく増えないという現象が起こりうるか」ということでした。 皆さんからのご意見では「テンプレートが過剰量である」ということでしたが 詳細を申し上げますと、５０マイクロの系でＰＣＲをしておりまして 原液、１０倍、１００倍、１０００倍、１００００倍希釈した産物を１マイクロずつ加える５通りを既に試してみましたが、どれもまったく増えませんでした。 ＡＰ様がおっしゃるようなスメアなバンドはなく、未反応のdNTPだけが検出される状態で、ウェルも若干光ってみえますが、これはゲルにエチブロを加えているためではないかと考えています。 （流れ出なかったエチブロがウェルの所で光ることが今までにもありました） これ以上薄いテンプレートの条件を試すことに意味があるとは思えないのですが、いかがでしょうか。 現在シーケンス解析のためのサンプル調製を終え、発送するところなのですが、 当ラボでは隣の国の会社に外注しているため、解析結果が出るまでに時間がかかります。 それまでの間に何かできることはないかなと思うのですが・・・・・ まあ、他のプロジェクトの実験に専念することにします。 シーケンス解析の結果、正しい配列を持っていることが分かれば、 トラフォメがうまく行かなかったのは私のスキルによるところということになりますね。 でも材料がちゃんとしていることが分かった訳ですから安心して再トライしてみます。 その場合PCRで何が起こったのかは迷宮入りになりますが、 おお様がおっしゃいます通り、問題はひとつとは限りませんし 理論的に考える価値のあることだとは思えませんので深追いしないことにします。 くだらない質問でお時間を頂戴し失礼いたしました。 お付き合いいただきまして感謝しております。

(無題) 削除/引用 No.2737-9 - 2009/01/27 (火) 13:45:43 - AP 鋳型過剰もPCRに失敗する原因ではあります。 しかし、増えないというより、重合がおこって、電気泳動するとウェル付近に固まっていたりスメアになる（そのために目的のサイズにバンドがない）ことが多いように思います。 そんな泳動像であれば、そうじゃないかと予想がつきます。 当然ながら、こういうことはサイクル過剰でも起こります。鋳型が多めならサイクルを減らして（15回とか）調整することもできましょう。

(無題) 削除/引用 No.2737-8 - 2009/01/27 (火) 13:27:02 - おお >[Re:7] ザンギさんは書きました : > 形質転換を躊躇されてるあたりから、よく勉強しているけど経験の浅い方とみました。（失礼） > > すでに回答がでてますが、僕なりの予想でポイントを絞り込むと、 > > 2nd PCRがうまくいかないのは鋳型が多すぎるんでしょう。 んーその可能性は私も考えたんですがね、、、 たしかに私がやって自覚がある時はテンプレート 量をさげますが、、、 そのへんが経験のさ何でしょうか、、、、 PCRフラグメントがテンプレートだから、 配列の複雑性を考えると、そんなに気にしなくても かかるような気がしがしますが、、、、、 一回量減らしてやってみる、とぴ主さん?

(無題) 削除/引用 No.2737-7 - 2009/01/27 (火) 13:03:32 - ザンギ 形質転換を躊躇されてるあたりから、よく勉強しているけど経験の浅い方とみました。（失礼） すでに回答がでてますが、僕なりの予想でポイントを絞り込むと、 2nd PCRがうまくいかないのは鋳型が多すぎるんでしょう。 クローニングするには、1st PCR産物はPCR反応後すぐに精製するを勧めます。 理由は皆さんの書かれたとおり。

(無題) 削除/引用 No.2737-6 - 2009/01/27 (火) 09:52:23 - おお >[Re:3] トピ主です。さんは書きました : > 最初のプラスミドが頂き物で量が少ないため、それをトラフォメしてクローニングして・・・・・というところからやらないといけません。 うまくやれば2日で精製まで行けますよ。それも殆ど待ち時間ですし、 いまは１日にその気になったら5回以上PCRかけれますが、 それでもPCRの条件とか壷にはまって1週間たってしまう なんてありがちなことですし。 > まずご質問の件ですが、１回目のＰＣＲ産物を、目的シーケンス中にある酵素サイトで切断し、理論通りのサイズのバンドが２本ですることは確認できています。 しかし、変ですね。 やはりシーケンスしてみます、、、それで解決するのかな?

(無題) 削除/引用 No.2737-5 - 2009/01/27 (火) 09:49:47 - あるば 1回目のPCR（プラスミドをテンプレート）で増やしたPCR産物を 2回目のPCRのテンプレートとして使用する際に、 テンプレートを入れすぎていませんか。 50マイクロLのPCR反応系に、PCR産物100倍希釈を1マイクロLで 十分だと思います。それでも多すぎかもしれません。 サンプルが多すぎるとPCRのかかりが悪いと聞きます。 確かに、1回目と2回目を同じプライマーで増やすと、 1回目に比べて増えが悪いと感じることはありました。 原因はAPさんの言われるようなことかなと勝手に解釈しています。 貴重なサンプルから難しいクローニングを行う時など、 PCRを2回かける可能性がある時は、目的のプライマーより外側に 1回目のプライマーを作ってNested PCRになるようにしていました。 ただ、全然増えないというのは、はて？とは思いますが…。 これは蛇足ですが、サイクルを増やせばその分変異が入る可能性が 増えますので、クローニングする時にPCRを何度もかけるようなことは 可能な限り私はしません。 ましてや、今回は元になるプラスミドがあるということですので プラスミドを増やしてPCRテンプレートとして使用する事をお勧めします。 さらについでで上手くいっていないサブクロですが、 本当に手技に問題が無いとすれば、 多分プライマーに載せているであろう？制限酵素サイトの足場が短いとか 選択した制限酵素が末端だと切れにくいとかで、そもそもPCR産物側が 制限酵素処理されていないと私なら考えます。 平滑末端になるPCR酵素を使っているのであれば、 プライマーをリン酸化してPCRし、SmaIやEcoRVでプラスミドを切って 挿入するとはいるかもしれません。 ご参考までに。

(無題) 削除/引用 No.2737-4 - 2009/01/27 (火) 08:40:58 - AP PCRの後、産物は何かしらの精製はしているのでしょうか。 3' exonuclease活性のある酵素だと、適切な精製をしていないと末端が削れこみを起こして、末端が5'突出の一本鎖になっていて、制限酵素で切れていないとかPrimer annealing seqがなくなっているとか、という可能性はあると思います。

おお様への回答 削除/引用 No.2737-3 - 2009/01/27 (火) 08:29:58 - トピ主です。 おお様 　 貴重なお時間をいただきコメント下さいまして恐縮です。 まずご質問の件ですが、１回目のＰＣＲ産物を、目的シーケンス中にある酵素サイトで切断し、理論通りのサイズのバンドが２本ですることは確認できています。 このことから、この産物が目的の物であるという印象を受けてはいるのですが・・・・・ また、ライゲーションのために２種類の制限酵素で処理して電気泳動し、ゲルから抽出したものを再度ゲルに流すと同じサイズのところにバンドを検出することも確認できています。 この２種類の制限酵素がきちんと活性を持っていることはベクターを処理する別の操作上で確認しています。 「ＰＣＲで変なことが起こるなら、切り出しで・・・・」とのご意見ですが、 最初のプラスミドが頂き物で量が少ないため、それをトラフォメしてクローニングして・・・・・というところからやらないといけません。 他にやることもないので、やってみようとは思いますが、 まず私の頭で考えられないこの状況が起こりうるのかどうか皆様にお伺いしたかった次第です。

(無題) 削除/引用 No.2737-2 - 2009/01/27 (火) 07:39:53 - おお いや、あの普通の分子生物学的手法ですが、 お示しのように非常に他段階のステップですし、 それぞれの点で問題点になる事を挙げていたら、 あなたの書いているコメントの10倍ぐらいの量 になってしまいますよ、、、、 こういうのはここに問題があると思っても、 違うところに問題があったりして泥沼に はまってらっしゃる方もおおいと思いますし。 PCRが2度目でかからないというのは PCR産物がノンスペというのが一番あり得そうです。 あるいはスーパーコイルのバンドみてるかな? だいたいエチブロで辛うじて見えるだけのテンプレート があればトランスフォーメーションに十分なのに ぶっといバンドがでているのにさらにPCRというのが むだなようなきがします。 こうかふこうか、それでPCRがあやしいという感触が 得られているわけですが。 シーケンスもいいと思いますが、ノンスペならきれいに読めず また泥沼にはまるかもしれませんね。 簡便な確認方法としてはそのインサートに中にある制限控訴 認識配列をつかい、理論通りに切れるかを見るというのを たまにします。Sau3A1などの4ベースカッターや比較的認識 配列出現頻度の高い酵素を使えば、大抵サイトがみつかる と思います。 バンド切り出した後、電気えいどうで同じ場所 にバンドが出ますか? PCRで変なことが起こるなら切り出してやった方がいい かもしれませんが、いい酵素がないのでしょうか?

2nd PCR 削除/引用 No.2737-1 - 2009/01/27 (火) 06:32:42 - ポスドクなのに・・・・・ どうしても理解できないことが起こっておりまして、皆さんのお知恵を拝借したく投稿いたしました。 ある遺伝子を別のベクターに導入することを目的に 先ずはインサート調製として、その目的遺伝子を含んだプラスミドをテンプレートにしてPCRをしました。 ベクターサイズは約６Ｋ、目的遺伝子のサイズは約１．５Ｋで、相当サイズ（1500bp）のPCR産物を得ました（アガロースゲル電気泳動にて確認） これを２種類の制限酵素で切断し、トランスフォーメーションしたのですが、コロニーが得られませんでした。 その理由について一般的に考えられることをすべて試したつもりですが、やはりコロニーは取れませんでした （詳細を説明することは敢えて省略させてください。とても長くなることと、このトピックの本題ではなくなるためです。ただし皆様にご教授いただくために必要な情報があるとすれば説明することはやぶさかではありません） 条件を変えて何度もライゲーションをしたため、調製したインサートを使い切ってしまい、また新たに調製することにしました。 ところが、調製したインサートをテンプレートにしてPCRをしても産物が得られませんでした。 もちろんこのテンプレートには制限酵素処理もなされておりますし、原因について思い当たる節がない訳でもないので、再度先述のプラスミドを用いてPCRを行いました。 そして前回と同じように相当サイズのクリアーな太いバンドを確認したのですが、 今度は多めにインサートを調製しようかと思い直して さらにその産物をテンプレートに２度目のPCRをしたところ、やはり産物は得られませんでした。 つまり、プラスミドをテンプレートにした場合には増幅されるが、その産物をテンプレートにしてもまったく増えないという状況が起こっています。 テンプレート量については濃度をふってかなりの量を試してみましたので問題はそこにはありません。 また、もちろんポリメラーゼ、dNTP、プライマーなど、PCRに用いた試薬と条件はすべて同じです。 テンプレートはそのまま使用した場合と、精製してから（市販のキアゲンのPCR精製キット、ゲル抽出キット、キットを使わないゲル抽出を試しました）使用した場合の両方とも産物は得られませんでした。 理論的に同じプライマーで増えない訳はないと思いますが、念のため別にデザインしたプライマーを使ってみましたが、やはり１回目のPCRは増え、２回目のPCR増えないという結果になっています。 さらに、この現象は他のまったく別の遺伝子を持つコンストラクトでも起こっており、問題はシークエンス由来のものではなく、PCR操作にあるものと考えております。 最終目的はトランスフォーメーションですので、どのような過程であれ、産物が増えれば良いというご意見をいただくかもしれません。 それはある意味ごもっともなのですが、ライゲーション・トランスフォーメーションが結果的にうまくいっておらず、私はこのインサート調製にすべての問題があると考えております。 １回目のPCR産物のシーケンスをチェックすることを考えておりますが、その前に皆さんの中に同様の経験をお持ちの方がいらっしゃるのかどうか、もしくは解決策についてアイデアのある方、ご教授いただけますと幸いです。 宜しくお願い致します。

全14件 ( 1 〜 14 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---