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(無題) 削除/引用 No.2735-16 - 2009/01/30 (金) 11:10:52 - AP >[Re:13] IPTGさんは書きました : > 　このようにWhole cell lysateのSDS Page とwesternでは検出されないのに、精製後に検出されるということはありうるのでしょうか？ > > 　また、このようなタンパクの場合、タンパク発現の条件検討を行うとき、各条件（IPTG濃度、培養時間）毎のサンプルを毎回精製までしないと検討できないものなのでしょうか？ ふつうはそんなことなくて、菌体をそのままサンプルバッファで溶菌してSDS-PAGEでいいはずです。これで、発現しているかどうか、サイズや量はどうなっているかを見ておかないと、精製過程でロスしても、分解が起こっていても見当がつきません。 ただ、ひょっとしたらと思うのは、このフォーラムでもたびたび話題になっているように、サンプル調製でボイルをしてしまうとアグる疎水性タンパク質のようなものがあるので、目的のタンパク質がそうなのかもしれないということです。それでサイズがとんでもなく大きくなっているとか、分離ゲルに入っていないとか。精製したサンプルだと見えたのは、精製したからではなく、グアニジンを使ってlysateにしたからとか。 だとしたら、尿素でlysateにしてボイルなしでアプライというのはよさそうですね。

(無題) 削除/引用 No.2735-15 - 2009/01/29 (木) 00:09:31 - A >[Re:13] IPTGさんは書きました : > 　それともAさんのおっしゃる > ＞私は8MUrea+PBSでWhole cell lysateを抽出して（もちろんこの場合は > 煮沸なしでSBと混合後ゲルへ）WBで発現確認をしています。 > 　 > 　このやり方なら、今回のようなタンパクでもWhole cell lysateから検出できるものなのでしょうか？ > > 　ご教示お願いします。 質問の意図をうまく理解していないのですが8MUrea+1xPBSでWhole cell lysateを抽出するのは上清、沈殿に限らずとにかく目的タンパク質 発現がどれほどなのか知りたい時に使います。 たとえば最終的にはどれほど上清に発現しているかが問題なのだからと ソニケーションなどで抽出して各条件の発現量を調べたとすると 各サンプル毎に本当に均一にソニケーションできているのか（サンプルの 体積やソニケーション時の溶液中でのソニケーターの位置などの違いに よる破砕効率の差など）などにより見かけ上の差が出来てしまう可能性が あるのですが、Urea抽出であればその辺りの差が出にくいというメリット があります。プロトコールは １．1mL培養液から回収したペレットを200uLの8MUrea+1xPBSで溶く。 ２．室温で一晩放置 ３．5uLをゲルにのせてWB という感じでやっています。もし知りたい情報とかけ離れていましたら 再度書き込んでください。

(無題) 削除/引用 No.2735-14 - 2009/01/28 (水) 09:35:00 - おお >[Re:13] IPTGさんは書きました : > 　このようにWhole cell lysateのSDS Page とwesternでは検出されないのに、精製後に検出されるということはありうるのでしょうか？ まず、GEのGSTのカタログとか、ノバジェンのタンパク発現にかんするカタログとかみてください。ノバジェンは詳しいハンドブックも出していたと思います。典型的なれいでは、インダクション前後で比べてCBBで確認できるぐらいの発現できるポテンシャルをもっています。そんな量のタンパクをウエスタンしたら非常に強いジグなるが出て隣のレーンまで真っ黒になりそうなくらいです。しかしやはり外来のタンパク質を発現させるとそうは行かないということがよくあります。 それでも、辛うじてでも良いからCBBで誘導がかかっているか見れる位は欲しいものです。場合によっては精製後1%位SDSPAGEにのっけて辛うじてCBBで染まるくらいえられて、バイオケミカルな分析をするのに十分の量で実験にさしつかえなかったということもあります。ただそれ以下になるとやはり実験として成り立つかどうか疑問に思えますね。 大腸菌がそういうタンパクを発現しない理由は多々あると思います大腸菌に対して毒性があるばあい。こういう場合はしばし大腸菌の生育が遅くなります。プラスミドの抜ける頻度も高くなりますので、こうせい物質のききぐあいに関しても注意が必要です。とくにAmpに関してはノヴァジェンのハンドブックなどに詳しく書かれていると思います。 また、ATリッチやGCリッチのはいれつは、大腸菌のレアーコドンを使う頻度が高くなり結果的に発現できないばあいがあります。レアーコドンにたいするtRNAを補った大腸菌が何種類か出ていますのでためしてみるのもてだと思います。結構ドラスティックに変わることがあります。 あとは発現させようとしている遺伝子配列が偶然大腸菌にとって意味のある配列となっているために思ったように発現しないばあいがります。知り合いはよくSD配列の有無をよく調べていました。この手の原因は解決することもありますがそうでないこともありますし、具体的な指針がたてにくいです。違うコンストラクトを漠然とためすとか、、、そういう意味では違うシステムに移行した方がいいかもしれませんね。 > 　また、このようなタンパクの場合、タンパク発現の条件検討を行うとき、各条件（IPTG濃度、培養時間）毎のサンプルを毎回精製までしないと検討できないものなのでしょうか？ 上記のようにそんなことはないと思います。 ウエスタンでひっかからないほどであればしんどいという感覚は あります。ただそれはどんな実験をするかしだいですので、 個々の実験で判断するしかありません。 あなたのやっているウエスタンの感度は把握されていますでしょうか? その状況で簡便にやるなら、タグにたいするレジンが有効な条件で1m 位のライセートをえて、少量のレジンをほりこんでぷるダウンし、 それをPAGEに持っていくということもありかもしれません。 あなたの実験でそれくらいの量でいいと思えるならそういう方法も 可能ということです。 あなたが発現しようとする遺伝子はプロテアーゼとかいうことは ないでしょうか、、、、

(無題) 削除/引用 No.2735-13 - 2009/01/28 (水) 00:25:08 - IPTG >発現の条件検討なんかなら、100 uLくらいの培養液をとって遠心で集菌し、十分量（たとえば0.5 mL）のサンプルバッファーで再懸濁、ボイルして、少量とってSDS-PAGEにかけます いつもこの方法でSDS-pageおよびwestern（His-tagタンパクなのでHis抗体で）を行っているのですが、目的タンパクが検出されません。 　ただ、グアニジンで可溶化後、Ni-NTAを用いてバッチ法で精製した後、再度SDS page およびWesternをおこなうと、SDS pageでも抗His抗体および目的タンパクに対するモノクローナル抗体でも検出することができます。 　しかし、収量を上げるため、タンパク発現の条件検討を行おうと思っています。 　このようにWhole cell lysateのSDS Page とwesternでは検出されないのに、精製後に検出されるということはありうるのでしょうか？ 　また、このようなタンパクの場合、タンパク発現の条件検討を行うとき、各条件（IPTG濃度、培養時間）毎のサンプルを毎回精製までしないと検討できないものなのでしょうか？ 　それともAさんのおっしゃる ＞私は8MUrea+PBSでWhole cell lysateを抽出して（もちろんこの場合は 煮沸なしでSBと混合後ゲルへ）WBで発現確認をしています。 　 　このやり方なら、今回のようなタンパクでもWhole cell lysateから検出できるものなのでしょうか？ 　ご教示お願いします。

(無題) 削除/引用 No.2735-9 - 2009/01/27 (火) 23:50:25 - AP >Westernをおこなうと、抗His抗体および目的タンパクに対するモノクローナル抗体で検出することができます。 >　しかし、薄いバンドしか検出されないため、収量を上げるため、タンパク発現の条件検討を行おうと思っています 直感的には、発現系（ベクターやら）を根本から変えないと無理っぽい。 抗体を使ってようよう検出できる程度しか発現しないのは、発現したタンパク質が毒性の場合に良くあります。 分泌系の融合タンパク質にするとか、無細胞系とか（Rocheのプロテオマスター？とか）

(無題) 削除/引用 No.2735-7 - 2009/01/27 (火) 21:08:24 - AP >単純に発現量を確認する場合にはWhole cell lysateをSDS pageで流してチェックすればわかるものなのでしょうか？ 発現の条件検討なんかなら、100 uLくらいの培養液をとって遠心で集菌し、十分量（たとえば0.5 mL）のサンプルバッファーで再懸濁、ボイルして、少量とってSDS-PAGEにかけます。ゲノムDNAで粘性がありますが、じゃまなら遠心して上澄みを使います。それでもサンプルにDNAが混じって泳動像が乱れることがありますが（バンドが一部、尾をひいたり）、チェックには十分です。これならサンプリングが簡単で、スモールスケールで細かく条件を振るのに最適です（IPTG濃度、タイムコースなど）。これでまず、発現したタンパク質が可溶性にいっているか、封入体にいっているかにかかわらず発現の様子を見ます。 lysateを泳動するときは、遠心して可溶性と不溶性にわけ、可溶性だけでなく不溶性のほうもサンプルバッファーで再懸濁して流します。案外、というかかなりの場合、発現したタンパク質は可溶性のほうにはさっぱりないけれど、不溶性のほうにはたっぷりあったりします。 たぶん温度を下げるのは、むしろ発現量が減るまたは生成速度が遅くなると思います。

(無題) 削除/引用 No.2735-6 - 2009/01/27 (火) 20:53:29 - A >単純に発現量を確認する場合にはWhole cell lysateをSDS pageで流して >チェックすればわかるものなのでしょうか？ 私は8MUrea+PBSでWhole cell lysateを抽出して（もちろんこの場合は 煮沸なしでSBと混合後ゲルへ）WBで発現確認をしています。私の個人的な 印象ですがこの方法だと煮沸した精製タンパク質のコントロールに比べ シグナルが弱いように思います。 また以前はソニケーションで上清に来るタンパク質を抽出タンパク質 として、同時にペレットにSBを加えて煮沸・遠心後の上清を沈殿に 行ってしまったタンパク質としてその量を比べていました。 あと25度での誘導ですが過去に2つの研究室で良く低温での誘導を 行っていましたがやはり TK-1さんがおっしゃっているような方法で した。 > 温度を下げて発現量が上がることはあるんでしょうか？ 発現を遅くしてフォールディングの時間を稼いでタンパク質がなるべく 上清に来るようにするのが主な理由のはずです。25度どころか人に よってはもう大腸菌が分裂出来ない16度や18度で誘導をかけて一晩で はなく数日タンパク質発現をすることもあります。この辺りで改善が 見られるかどうかは発現タンパク質によりますから条件検討してみる しかありません。

(無題) 削除/引用 No.2735-5 - 2009/01/27 (火) 19:58:24 - IPTG 初心者なものですみません。 　単純に発現量を確認する場合にはWhole cell lysateをSDS pageで流してチェックすればわかるものなのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2735-4 - 2009/01/27 (火) 10:14:30 - 千夏 OD600=0.6になるまでは37℃で培養し、その後25℃のインキュベーターで30分precultureします。preculture後、IPTGを添加して、まずは4時間培養してみてはどうでしょうか？？IPTGは1mMと0.1mMの2つ試してみれば、おおよその傾向はでると思いますｖ 1) OD600=0.8-1.0にする 2) 誘導時の温度を20℃にする 3) single colonyを250mlの培養液で25℃, 16 h培養した後に37℃でOD600=0.6まで育ててから25℃に戻して誘導をかける 4) IPTGを8時間してみる soluble frctionのタンパク質を多くしたいのならこの辺が試してみる価値あります。 単純に発現量を増やしたいのであればIPTGの量と誘導時間の調整が検討対象になるかと思いますｖ

(無題) 削除/引用 No.2735-3 - 2009/01/27 (火) 08:07:52 - おお > IPTGでタンパク発現誘導を行っているのですが、37℃では少量しかタンパクが誘導されないため、25℃もしくは30℃で時間を振って誘導させてみようと思っています。 >[Re:2] TK-1さんは書きました : > 温度を下げて発現量が上がることはあるんでしょうか？ 私も同じような疑問をもちますね。 発現量はどうやって調べたのでしょうか? 可溶化フラクションの量で判断している としたら、発現量とはいえないですよね。 低い温度にするのはいろいろな理由があります。 プロテアーゼのアッタクをへらす。 発現量を抑えてインクルージョンボディーの 形成、移行をふせぐなどです。 低温でやってみてもいいと思いますが、 一度コドンユーセージなども考慮に入れてみてください。 方法論てきにはうまく行けばOKなので、どうこう しないといけないいうのはないですが、条件がぶれないで、再現できる 方法をとるのが、いいかと思います。

http:// 削除/引用 No.2735-2 - 2009/01/27 (火) 06:31:59 - TK-1 温度を下げて発現量が上がることはあるんでしょうか？soluble fractionにある蛋白を増やすことは可能かもしれませんが、全体の発現量が上がるかどうかは？？？です。 取りあえず、やり方ですが、bacteria strainによってメーカーからの特に細かい指示がある場合でなければ、３７度で増やして、on ice５分、IPTGを入れて低温で誘導って感じです、

25℃でIPTGによるタンパク発現誘導をする方法 削除/引用 No.2735-1 - 2009/01/27 (火) 02:14:07 - IPTG IPTGでタンパク発現誘導を行っているのですが、37℃では少量しかタンパクが誘導されないため、25℃もしくは30℃で時間を振って誘導させてみようと思っています。 　このように37℃以下で培養する場合、IPTGを添加する前からOD0.6付近になるまで25℃もしくは30℃で培養をするものなのでしょうか？それともIPTG添加前までは37℃で培養し、添加後25℃もしくは30℃に下げるものなのでしょうか？

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