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(無題) 削除/引用 No.2732-4 - 2009/02/07 (土) 13:56:07 - 400 tontanさん、組織さん返信ありがとうございました。 お礼や返信が遅れ申し訳ありませんでした。 結果から言うと凍結切片でのPAS染色はあきらめました。 まず組織さんが言われていた後固定の時間を0〜2hまで行いましたが染まりませんでした。風乾の時間も同様に検討しましたが変わらずでした。 そこでtontanさんが言われたどの段階で染色性が失われているかを確認するため、4％PFA固定後の凍結切片作製を行うと、風乾後に固定するしない関わらずアクロソームが染まりました。 しかし、その後未固定組織の条件を変えるのがもうあまり無いので、H.E.で染色した精母細胞、円形精子細胞、精子を観察してある程度のステージ分けを行う事にしました。 染色ができたわけではありませんが、貴重な御助言をいただきありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2732-3 - 2009/01/28 (水) 22:43:37 - 組織 固定条件だと思います。PASではないですが、以前トルイジンブルーがうっすらとしか染まらなくて困ったことがあります。その時は固定を思い切り強くしたらしっかり染まるようになりました。試しにPFAで1〜2時間、メタノール30〜60分くらいで固定してみて下さい。固定液や固定条件は実験目的に合わせて別途最適化して下さい。パラフィン切片だと標本作製過程で組織がエタノールやキシレンに長時間浸かっているので、過固定で染色性が落ちるということはないと思います。

PAS染色 削除/引用 No.2732-2 - 2009/01/28 (水) 17:57:00 - tontan コントロール標本のパラフインのアクロソームが染まっているなら、Schiff 試薬に問題はなさそうですね。一般論ですが、PAS 染色にはエタノールが混ざっているカルノアとか、ホルマリンとエタノールの混合溶液の固定液を使うと良いようです。それと、固定してから切片にするのと、切片にしてから固定するのとでは物質の流出度が違うのではないか、切片を固定液といえども20分も入れておいていいかな？と感じますが。 凍結で、どの段階でPASの染色性が失われるかの確認は必要かもしれませんね。凍結切片にして風乾だけで染めてみる。それで染まらなければ、OCTが染色性を阻害しているかもしれない、ならばOCTを使わないで切片を作って染めてみる。そのときは腸管とか肝臓とかの陽性コントロールを置いて同じ方法で行ってみる。それでだめなら凍結法自体を考え直してみる。凍結方法は液体窒素にボチャンですか。細かいところ、考える余地はありそうですね。

PAS染色 削除/引用 No.2732-1 - 2009/01/26 (月) 19:52:54 - 400 現在、精巣の未固定凍結切片にてPAS染色を行い、アクロソームを染めて精子サイクルを同定しようと試みています。 しかし、円形精子細胞自体は見えるのですがアクロソームが染まりません。 コントロールとしてパラフィン切片を一緒に染めるとパラフィンの方はきれいに染まるので染色の問題ではないと考えています。 現在の手法としては、OCTコンパウンドで包埋、10μ切片を作成後風乾し4%PFA20分固定で染色に入っています。 PFAをpH7.0、7.4、8、10で行いましたが変わらず、未固定や切片を3、6、14μとしても変わりませんでした。 あと考えられるのは固定液かな？とは思うのですが、パラフィンの場合、精巣は10％ホルマリンなどでは構造が壊れてしまうのでブアンか4%PFAがよかったので検討はしていません。 どなたか経験のある方や何か気になった事などアドバイスをいただけないでしょうか？よろしくお願いします。

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