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(無題) 削除/引用 No.2721-10 - 2009/01/30 (金) 11:47:32 - AP >鋳型DNAを直線化させたバンドだけ精製すれば解決されるのでしょうか？ わかりません。望みは低いかもしれません。 結局、片側プライマーでPCRラベルという方法で解決してしまいましたので。 プロモータ付きベクターにクローニングしたものを鋳型として利用することに起因する問題であれば、プロモータ配列を付加したプライマーでPCRした産物を鋳型にするといいかもしれません（この方法は以前のトピでどなたかか情報をあげておられました）。

(無題) 削除/引用 No.2721-9 - 2009/01/30 (金) 02:07:04 - しばた APさん、 下記に示された可能性が生じた場合の対処方法を教えてください。鋳型DNAを直線化させたバンドだけ精製すれば解決されるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2721-8 - 2009/01/29 (木) 13:56:10 - AP >[Re:6] しばたさんは書きました : > 質問への便乗ですが、もしRNAプローブを用いた場合に見られるセンスプローブへの染色が見られた場合、同様の問題点が挙げられるのでしょうか？ そうですね。それに加えRNAプローブをin vitro transcriptionで作った場合、かなりしばしば、反対鎖のプローブができるようです。センス、アンチセンスとも作ったプローブは、一度Northern blotに使ってチェックすることをおすすめします。どちら側のプローブも同一のパターンのバンドを検出することがかなりあります。もしも本当に遺伝子の反対鎖も発現しているとしても、サイズなどのパターンが一致するとは考えにくいですよね。 可能性としては、 ・in vitro translationで反対鎖への鋳型の乗換えが起こっている。環状の鋳型や、鋳型の終了端が3'突出になっているとそういうことが起こるといわれている。しかし、それをふまえて末端を5'突出の制限酵素で切っておいても上記のようなことは経験します（線形にした鋳型をゲルぬきして精製したことはないので、ひょっとすると微量の環状が切れのこっている可能性は否定できません）。 ・鋳型DNAの残留によって、標的RNA-鋳型のアンチセンス-センスプローブのようにハイブリが起こっている。 というようなことを想像しています。 代替方法として、PCRラベルで片側のプライマーだけ入れて一本鎖DNAプローブを作る方法があります。経験上、こちらのほうが問題が起こりにくいようで、RNAプローブがstrand-specficでなかったものを、この方法でやり直したらうまくいったこともありました（以来、この方法をデフォにしている）。

(無題) 削除/引用 No.2721-7 - 2009/01/29 (木) 08:30:48 - CJ ISHにおいて、何をもって「特異的な染色」を決めるのは実は難しい問題です。 厳密なコントロールというものを設定することが困難だからです。先述のとおり、アンチセンスが発現する可能性があるからです。ではいわゆる達人とされる人はどのように「特異的」かを判断しているか、ということですが、特徴的な染色パターンを持って「特異的」と判断していることが多いようです。「それは科学的とはいえない」といわれればその通りです。 一部の人は植物ゲノムから同一GC比率の配列を取ってきてネガコンとしているようです。 ご質問の件ですが、先行研究とか、Allen Brain Atlasなどを参考にされてはいかがでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2721-6 - 2009/01/29 (木) 07:39:04 - しばた 質問への便乗ですが、もしRNAプローブを用いた場合に見られるセンスプローブへの染色が見られた場合、同様の問題点が挙げられるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2721-5 - 2009/01/26 (月) 22:22:01 - CJ オリゴプローブは感度が低いため、最近はあまり使われません。 感度が低いため、シグナルを上げるために条件をゆるくせざるを得ず、非特異的染色が出やすくなるのです。 １０００ｂほどのRNAプローブが感度、特異性共に優れています。 もう１点ありうることとして、テーテンさんの上げられているようにアンチセンスの発現です。いくつかの遺伝子について特異的な発現が報告されているようです。

(無題) 削除/引用 No.2721-4 - 2009/01/26 (月) 21:24:51 - A 私もAPさんと同じように非特異的なシグナルを疑いたくなりますね。 Wash処理はどんな感じですか？ハイブリ後、十分に行われていますか？ 私もそれほど詳しくはありませんがもし問題が無いのであれば プロトコールの詳細をここに書き込んでみて皆さんの意見を聞いてみると いいかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.2721-3 - 2009/01/24 (土) 22:01:29 - AP 配列によらない非特異的な染色を見ている可能性はどうでしょう。 ・染色パターンは両者一致していますか。それは特定の部位、細胞が染まっていそうですか（ユビキタスは染色ではないか）。 ・標識と検出の方法はなんですか？　標本はなんですか。標識方法や組織の種類によっては非特異的な染色が起こりやすいです（例えば、脂肪に富む細胞に、親油性のステロイドであるDIG標識とか）。

(無題) 削除/引用 No.2721-2 - 2009/01/24 (土) 17:47:13 - テーテン アンチセンスRNAが発現しているだけでは？

in situ hybridizationでセンスプローブも染まってしまう 削除/引用 No.2721-1 - 2009/01/24 (土) 16:21:20 - iHS 合成DNAオリゴプローブを用いてin situ hybridizationを行いました。 ところが、アンチセンスプローブだけでなく、センスプローブまで染まってしまいます。 これは何が問題なのでしょうか？ 合成したプローブは34merでしたが、特異性をあげる目的で45mer程度にするのも解決法のひとつでしょうか？ そのほか、プローブのデザインをし直す際のポイントがあれば、アドバイスをお願いします。

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