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モノクロでのウェスタンについて トピック削除
No.2713-TOPIC - 2009/01/23 (金) 17:28:06 - 試行錯誤
ウイルス中和能をもつモノクロの認識するウイルス構造蛋白を決定するため、ウイルス精製物をSDS-PAGE後にウェスタンを行い、ECLなどで検出しているのですがうまくいきません。ポリクロでは各構造蛋白のバンドが検出できているので手技や系としては問題ないと思っています。この原因はSDSより認識部位も変性されてしまったと考えていいのでしょうか？次は免疫沈降を試そうと思っています。
　
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(無題) 削除/引用
No.2713-11 - 2009/01/26 (月) 10:18:29 - 試行錯誤
いろいろとアドバイスして下さりありがとうございます。
IP後の検出ですが、全てのウイルス構造蛋白をWB検出できるウサギ免血を持っているので、これで当ててみようと思っています。
2ME無添加のSBも試してみます。

(無題) 削除/引用
No.2713-10 - 2009/01/25 (日) 16:38:32 - EcoRI
>さらに、ドットブロットでは分子量分からないですし、どういう蛋白が反応しているかの最初の目的は達成できないのでは？
ドットブロットを提案したのは、トピ主さんが、
>SDSより認識部位も変性されてしまったと考えていいのでしょうか？
と問題提起されたので、
その解決法の１つを示しただけして。

もちろん、どんなタンパク質が？ということには、ドットブロットは使えません

disulfide bond 削除/引用
No.2713-9 - 2009/01/24 (土) 14:43:45 - おお
How about contribution of disulfide-bonds to generate the epitope structure against the antibody.

So, you might want to run SDS PAGE without DTT/betaME in your sample buffer.

Good Luck!

(無題) 削除/引用
No.2713-8 - 2009/01/24 (土) 14:28:40 - りょう
横から失礼します。
観ていて気になったのですが、IPできる抗体としても、その後の検出はWBでは今のところ無理な抗体なのですよね。
IP産物を銀染色などで観ようとされているのでしょうか？
IPで濃縮すれば検出限界以上になる可能性は否定しませんし、銀染で見える程度に特異的に濃縮できれば、そのバンドをマス解析し、最初の目的を達成することが可能かもしれません。

さらに、ドットブロットでは分子量分からないですし、どういう蛋白が反応しているかの最初の目的は達成できないのでは？

IPはキット(樹脂が充填されたカラムなど）を使用するより、まずはオーソドックスにproteinGやproteinAで回収するのが一般的では？使い慣れない・融通の利かないキットを使用してドツボにはまらないように。
あくまで１意見です。

(無題) 削除/引用
No.2713-7 - 2009/01/24 (土) 14:11:18 - EcoRI
免疫沈降はビーズと抗体がもったいないので、あまりやりません
CNBr-ShepharoseとかNHS-sepharoseとかに抗体を固相化して、
PD-10などの空きカラムに詰めて、何回も使ってます。

(無題) 削除/引用
No.2713-6 - 2009/01/23 (金) 17:52:21 - 試行錯誤
免疫沈降を行うとしてなのですが、よい方法もしくは製品等の情報はありますか？
現在、PIERCE社のSeize X ProteinGを検討しています。

(無題) 削除/引用
No.2713-5 - 2009/01/23 (金) 17:48:51 - 試行錯誤
ありがとうございます。
試してみます。

(無題) 削除/引用
No.2713-4 - 2009/01/23 (金) 17:48:39 - EcoRI
あ、そうか…
熱変性の可能性もあるから、それも加味して検討してみるのがいいかも

いずれにしろ、免沈で落ちてくればいいのですけれど。

(無題) 削除/引用
No.2713-3 - 2009/01/23 (金) 17:39:33 - EcoRI
モノクロではしばしば起こる、と聞きます。
別のクローン由来のモノクロがあれば、それを試してみるのも手ですね。

SDSで認識部位が変性した、ということを決定したならば、ドットブロットを試してみてはいかがでしょう？
SDS処理区と無処理区を試せばいいと思います。

(無題) 削除/引用
No.2713-2 - 2009/01/23 (金) 17:36:06 - A
モノクロでのWBではサンプルをSBと混合した後煮沸しないでそのままゲルに
のせるとシグナルが強くなることがあります。

モノクロでのウェスタンについて 削除/引用
No.2713-1 - 2009/01/23 (金) 17:28:06 - 試行錯誤
ウイルス中和能をもつモノクロの認識するウイルス構造蛋白を決定するため、ウイルス精製物をSDS-PAGE後にウェスタンを行い、ECLなどで検出しているのですがうまくいきません。ポリクロでは各構造蛋白のバンドが検出できているので手技や系としては問題ないと思っています。この原因はSDSより認識部位も変性されてしまったと考えていいのでしょうか？次は免疫沈降を試そうと思っています。
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