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(無題) 削除/引用 No.2710-8 - 2009/01/25 (日) 15:20:50 - 初心者 ご返信ありがとうございます。 みなさんの意見を参考にして、とりあえずプロトコール通りにＰＣＲをかけてみようと思います。 その結果があまり良くなければ、再度条件について検討したいと思います。 今回は誠にありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2710-7 - 2009/01/24 (土) 11:50:01 - おお その酵素は使ったことないですが、最初の変性のステップは あまり必要がないようにおもえます。 実際ほっとスタートをかけるため、温度が上昇するのをまって 最初の変性ステップにはいってから、チューブをせっとしてますので、 この最初のステップの時間は毎回若干違いますが、 ほとんどぶれません。 最後の72度数分間は、末端のエンドフィルを確実にするもので、 これをやらないとベクターなどにほりこむ時はかなりきいている なっと感じることがあります。 また、得られたバンドがクリアーでないときは、やってみて どれほど変わるか確認してもいいのかと思います。

パンフとかに書いてありますが 削除/引用 No.2710-6 - 2009/01/24 (土) 11:18:56 - こうじ ホットスタート用にモノクローナル抗体を使っているのは同じなのですが、 TaKaRaのうたい文句として１サイクル目の変性ステップで ポリメラーゼ活性が100%回復するということなので不要なのだと思っています。

(無題) 削除/引用 No.2710-5 - 2009/01/23 (金) 22:25:44 - DSC PrimeStar（HSとGXL）を使っています。 私も1のステップは抜かせないかなと思っていたのですが、いきなり98℃, 10secだけでもちゃんと増えることがわかったので、結局入れていません。が、コロニーPCRとかでは熱で細胞をぶっ壊してDNAを引っ張り出さなければならないので（そういう印象なので）、書かれているのと同じく94℃, 2minをあたまに加えてやってます。 3のステップも目的に応じて加えています。インサートチェックのような、増えるかどうかを調べるだけのときは加えませんが、増幅産物をクローニングに用いる場合には68 or 72℃, 5 or 10minを付け足しています。最後にダメ押しで伸長させて末端を揃えておく方が次のライゲーションなどの効率が良くなるような気がして…。特に長鎖のときは…。 どちらも私にとっては「気分」というか、おまじない的ですね。

prime starで 削除/引用 No.2710-2 - 2009/01/23 (金) 21:56:18 - a initial denature や final extentionを入れてやっていました。 これらの意義については教科書みたいなものに載っているかと思います。 入れる必要がない(いれてもいれなくても全く変わらない)かはわかりません。説明書の内容の詳しい部分は忘れましたが、メーカーとしては入れなくても十分な増幅が得られるという認識なのでしょう(トラブルシュートみたいな項に、いれてやると良い、みたいな記述はないのですよね)。 入れないでやってみても十分増えるなら、その系においてはとりあえず必要ないという結論がだせるかと思います。 答えになっていないかもしれませんね・・。

PCRのサイクル条件について 削除/引用 No.2710-1 - 2009/01/23 (金) 11:52:36 - 初心者 いつも参考にさせてもらっています。 今回はPCRのサイクル条件についての質問なのですが、初歩的な質問で申し訳ありませんが、お願いします。 今TAKARAのPrimeSTAR HSでのPCRを行なう予定ですが、この説明書を見たところ、 (98℃ 10sec→55℃ 5sec→72℃ 1min)x30cycles となっていますが、 今までに使ってきた酵素では 1. 94℃ 2min 2. (94℃ 15sec→57℃ 30sec→68℃ 1min)x30cycle 3. 68℃ 10min となっていたので、PromeSTARではこのような1や3のステップは必要ないのかどうなのかが疑問に思ったので質問しています。 PCRの原理は当然理解しているつもりなのですが、これら(1,3)のステップは時間や温度は変更したとしても必要だと認識していたので・・・ 本当に勉強不足なのは承知していますが、 TAKARAのPrimeSTAR HSを使ったことがある方から教えてくださると安心できますので、宜しくお願いします。

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