全8件 ( 1 〜 8 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.2704-9 - 2009/01/23 (金) 02:30:59 - AP >KODがEtOH pptで失活するかどうかはよく知りませんが、 多くの耐熱性ポリメラーゼは失活の最低条件としてフェノール抽出が望まれるようです（T4 polや一部の制限酵素ですらそうですから）。EtOH pptでは活性が残存する可能性は高そうです。

(無題) 削除/引用 No.2704-8 - 2009/01/23 (金) 01:21:51 - AP KODがEtOH pptで失活するかどうかはよく知りませんが、通常のEtOH pptではdNTPもかなり残留するし可能性がないわけではなさそうな気がします。できあがりの配列はinsertがbluntingされたと考えるとつじつまが合いますし。 さらに可能性をあげると、例えばblue/white selectionが可能なベクターで、ORFを含むインサートがlacZの転写と順方向になると、逆方向より出現頻度が下がることがあります。lacプロモーターによってinsert由来の発現が起こって、宿主に負荷を与えるためだと思われます。

(無題) 削除/引用 No.2704-7 - 2009/01/23 (金) 01:01:50 - おさかなさん AP様 ありがとうございます、とても勉強になりました。 PCR後のKODの処理について記載しておりませんでしたので追記いたします。 PCRの後、エタ沈を行ってから制限酵素処理を行っています。 エタ沈のみではfill-up　を起こす可能性があるのでしょうか？ あとご指摘のようにたまたま拾ったコロニーがこの状態だった可能性も考え 残りのコロニーを拾い、培養してきました。 もう1点、ご指摘いただいたrecombinantの割合は、私も気になっています。 以前BamH�T/Xho�Tで組み替えを行ったときも10コロニー中2個しか入っていませんでした。 周囲にPCR産物とvectorをligationしている方がいないので、このくらいの効率なのか・・・？？と疑問に思っていました。 （周りの方はTOPOを使用しています） 効率を上げるために注意する点などありましたら、お教えいただけないでしょうか？ よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.2704-6 - 2009/01/22 (木) 21:45:01 - AP 蛇足ですが >�@制限酵素処理　(3.5kb ３μgを20UでO/N処理)（Hind�V／Xho�T） >�A（エタ沈後）CIP処理→75℃で不活化３０min >�B泳動→切り出し（UVには当ててません） Alkali phosphataseは制限酵素バッファー（その他ほとんどの酵素反応バッファー）でも十分に働くので、制限酵素消化のあとEtOH pptは必要なく、そのままCIPを加えるのでいいです。最近はメーカーが（いらぬ）親切にもAlkali phosphataseに10x bufferをつけてきたりしているので、それで反応しなければいけないと思っている人もいるようですが。もしなにかしたいなら、Tris (amine?)の濃度が高いと活性があがるということも言われているので濃いめ (1 Mとか）のTris bufferを、少量加えてやる（制限酵素のスター活性が起こるので、塩濃度が激しく希釈されない程度に）といいでしょう（まあ、おなじないていど）。 CIPは加熱で失活できないので、あまり意味がありません。 あとで泳動・切り出ししているので失活の操作は不必要です。

(無題) 削除/引用 No.2704-5 - 2009/01/22 (木) 21:13:57 - AP >�@プラスミドを鋳型にPCR（予め制限酵素サイトHind�V／Xho�Tのついたプライマーを用いて。product size 3.8kb,KOD plus使用） >�A制限酵素処理　（約3μg を40Uで2hr） 制限酵素消化の前に精製（KODの失活）していないようですが。 KODの伸長活性で陥没末端のfill-upが起こってblunt-endになっているのでしょう。 なのでvectorのBamHI/XhoI末端にはligationされず、たまたま突出末端が削れてしまってbluntになったのとligationされたものがとれたのでしょう。 形質転換効率も、recombinantの割合も非常に低いように見受けられますが、たまたま、運良くそういうのができただけだからではないでしょうか。 2個しか見ていないので逆さまだったのは、たまたまでしょう。

(無題) 削除/引用 No.2704-3 - 2009/01/22 (木) 20:41:21 - おさかなさん 早速のご指摘、ありがとうございます。 シークエンスの結果は 5'→ vector側＊＊＊atcgag＊＊＊insert側 3'→ vector側＊＊＊cagctt＊＊＊insert側 のようになっています。

(無題) 削除/引用 No.2704-2 - 2009/01/22 (木) 19:24:37 - - どのような配列になってつながっているのか書いた方がいいと思いますよ。

double digestionなのにinsertが逆？？ 削除/引用 No.2704-1 - 2009/01/22 (木) 19:04:10 - おさかなさん いつも勉強させていただいております。 現在プラスミドの組み換えを行っています。 double digestion を行っているにもかかわらず、インサートの向きが逆になってしまい、どうしてこのような現象が起こるのか、ご教授を賜りたく投稿いたしました。 方法としては、 《インサート側》 �@プラスミドを鋳型にPCR（予め制限酵素サイトHind�V／Xho�Tのついたプライマーを用いて。product size 3.8kb,KOD plus使用） �A制限酵素処理　（約3μg を40Uで2hr） �B泳動→切り出し（UVには当ててません） �Cフェノクロ・エタ沈精製 →ライゲーションへ 《ベクター側》 �@制限酵素処理　(3.5kb ３μgを20UでO/N処理)（Hind�V／Xho�T） �A（エタ沈後）CIP処理→75℃で不活化３０min �B泳動→切り出し（UVには当ててません） �Cフェノクロ・エタ沈精製 →ライゲーションへ ライゲーションはvector:insert １：１ぐらいで行いました。（TAKARA　ligation Kit使用） 13個のコロニーを拾い、2個（＋）でした。 シークエンスの結果が、見事に“真逆”なのです。（2個ともです。） vector側のHind�Vとinsert側のXho�T vector側のXho�Tとinsert側のHind�V がきれいにつながっています・・・。 （しかし、この状態にもかかわらず、何故かHind�Vでcutできます） どういうことなのか、理解ができません。 他の遺伝子もHind�V／Xho�Tの組合せで行うと、逆向きに入ってしまいました。 どなたか、このような現象の原因と改善点をお教えいただけないでしょうか？ よろしくお願いいたします。

全8件 ( 1 〜 8 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---