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(無題) 削除/引用 No.2702-12 - 2009/01/25 (日) 15:21:00 - ななし カナマイシンさま、おおさま、 ありがとうございます。 検討してみます。

(無題) 削除/引用 No.2702-11 - 2009/01/24 (土) 15:24:32 - ge Cy5を用いたゲルシフトアッセイ http://www.gelifesciences.co.jp/contact/imaging/pdf/217091.pdf

detecting by 260nm OD 削除/引用 No.2702-10 - 2009/01/24 (土) 15:08:02 - おお After adding excess random oligomers, remove unbinding DNA from the protein with gel-filtration, dialysis or pull-down, and then measure OD at 260 and 280. You could see an increase in 260 OD. Make sure you do not have any DNA in your protein before mixing with oligomers. Best, >[Re:6] ななしさんは書きました : > 便乗で質問です。 > > あるタンパク質がDNA結合タンパク質である > ことを証明するにはどうすればよろしいでしょうか？ > 配列非特異的なDNA結合タンパク質の可能性が高いです。 > ゲノムDNAをRIでラベルしてゲルシフトなどが考えられますが、 > 施設の関係上non-RIが望ましいです。 > > なにか情報をお持ちの方がおられれば > 知恵を貸していただけると幸いです。

(無題) 削除/引用 No.2702-9 - 2009/01/24 (土) 13:51:24 - カナマイシン >ななし様 本当に非特異的結合なら、適当な生物のクロモソーム（自種のものが適当）を ソニケーションかなんかで短く切ったもの（平均0.5 kbとか1.0 kbとか）で いいんじゃないでしょうか。 RIが使えないなら私ならDIGで末端ラベルします。カンタンです。 雑多なDNA断片の集合でもラベルできると思いますが、 各断片のラベル効率のばらつきなど少し心配になるので、 「これは確実にくっつく」という断片（X）があるのであれば、 ・ラベルしたXのゲルシフトのレーン。 ・ラベルしたXのゲルシフト反応系に雑多なDNA（非ラベル）を 　過剰量混ぜて泳動したレーン（競合してシフトが見られなくなる） を並べるのがラクかなと思います。

(無題) 削除/引用 No.2702-8 - 2009/01/23 (金) 20:44:03 - AP 当面の方針が決まったようですが、蛇足を加えます。 >蛍光プライマーでラベルしたPCR産物（シス配列を含む）と相互作用タンパク質を混合したサンプルをNativePAGEしてから、ルミノイメージアナライザーで検出する方法を見つけたのですが、蛍光プライマーの価格が高いので、もう少し安くなる方法を探しています。 >イメージアナライザーの感度で検出かなど、経験が無いのでお教え頂けるとありがたいです。 蛍光プライマーは一分子一標識が普通で、非標識のプローブの末端にTdTで蛍光標識するのと標識量は同等ですから、蛍光プライマーを使う方法の代替にはなります。蛍光プライマーでPCRして作ったプローブで検出可能なレベルであれば、TdTで蛍光標識したプローブでも検出できるでしょう。要はターゲットがどれだけ豊富にあるかじゃないでしょうか。 各種Fluorescein-12-ddNTPは、Perkin-Elmerで販売しているようですね。これとTdTをそろえればKitがなくても可能です。たくさんのプローブを作るなら、いちいち標識プライマーをオーダーするより安くつくと思います。 ほかの標識方法としては、プライマーに5'突出の制限酵素サイトをつけておいで、PCR産物の末端をその制限酵素で切断し、標識の入ったdNTPとPolymeraseでfill-inするという手もあります。

(無題) 削除/引用 No.2702-7 - 2009/01/23 (金) 09:16:50 - miso ＞やまさき様 丁寧な回答有難うございました。蛍光標識の場合、感度の問題もあると思うので、まずはRIでトライしてみようと思います。 発現の少ない転写因子の場合と書かれていた点についてお教え頂きたいのですが、この場合の発現が少ないというのは大腸菌でのリコンビナントが出来にくいということですよね？　転写因子一般に、大腸菌での発現が少なかったりするのですか？ご存知でしたら回答お願いします。 ＞AP様 前回の質問の後、蛍光標識のキットについて調べてみました。Cy-3やCy-5、Rodamineなど5’端にラベルするキットは出ているようです。蛍光標識の場合、検出感度が低いというお話を耳にするので、実際使えるのかどうか知りたいと思いました。蛍光ラベルかRIを使うと、操作ステップが減らせると思ったので、DIG以外の検出法を検討していました。ですので、DIGのGel Shift Kitについては購入できることは、調べてあります。 やはり、内部を標識する場合は、シス配列部分の立体構造に影響を与えたりする可能性が高いですよね。運よく、シス配列の立体構造に影響をあたえなければ、検出出来たりもするのでしょうが... ご返信ありがとうございました。 ＞ななし様 ゲノムDNAでゲルシフトは不可能じゃないですか？　シフトしないと思います。

(無題) 削除/引用 No.2702-6 - 2009/01/22 (木) 23:50:06 - ななし 便乗で質問です。 あるタンパク質がDNA結合タンパク質である ことを証明するにはどうすればよろしいでしょうか？ 配列非特異的なDNA結合タンパク質の可能性が高いです。 ゲノムDNAをRIでラベルしてゲルシフトなどが考えられますが、 施設の関係上non-RIが望ましいです。 なにか情報をお持ちの方がおられれば 知恵を貸していただけると幸いです。

(無題) 削除/引用 No.2702-5 - 2009/01/22 (木) 23:44:31 - ななし 以前、エチブロかSYBRで前もって染めたDNAが タンパク質に結合するかどうかを観るゲルシフト法があるって 聞いたことあるんですけど。 聞き間違いだったかな？

(無題) 削除/引用 No.2702-4 - 2009/01/22 (木) 21:29:41 - AP 内部標識では、タンパク質のバインディングに影響がありますし、プローブの分子量も一定しないので（標識ヌクレオチドの取り込み量が分子ごとにふれがある）ので不可でしょう。 サイバーグリーンでやるというのはあらかじめ染めておいて使うというのでしょうか。いろいろな意味で無理です。インターカレーションで立体構造が変わるし、先染めはできない色素ですから。 以前のトピに触れられていたと思いますが、むしろ無標識のプローブでやって、ゲルをサイバーグリーンで後染めする方がまだ見込みがあるかもしれません（経験はありませんし、実施例も知りませんが）。 ビオチンやDIGで末端標識して（標識ddNTPとTdTで3'末端に一塩基の標識ヌクレオチドを付加）、AP標識の抗体などと化学発光法で検出するゲルシフトシステムは既存のものがあります（Rocheなど）。AP標識ではなく蛍光標識のものを使えば蛍光検出も可能かもしれません。あるいは蛍光標識のddNTPがあればTdTで直接標識もできるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.2702-3 - 2009/01/22 (木) 21:00:09 - qq やまさき様、便乗ですが、興味があるのでお教えください。 チオリン酸とは、Nucleotide-O-PO2Sのようなものを考えると良いのですか？ PNKのドナーは、ATPγSということでしょうか？ 出来たチオリン酸は、普通のチオールの様にマレイミドで標識できると考えてよろしいのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2702-2 - 2009/01/22 (木) 18:55:17 - やまさき 蛍光ラベルを末端ラベルにすればいいのではないでしょうか？ベクター社からT4PNKでチオリン酸を導入するキットが販売されています。（自分でも構築できますが・・・）導入後はFITCマレイミドを反応させれば終わりです。あとはフェノクロ・エタ沈で精製すればPCr readyになります。 仰っている内部標識でもよいとは思いますが、標識率が高いと蛍光分子によって転写因子などのタンパクとの結合活性が落ちるかも知れません。 ただ蛍光は感度が出しにくいと思われますので、発現量の少ない転写因子の場合は素直にRI使った方が良いと思われます。

蛍光ラベルしたPCR産物を用いたゲルシフトアッセイ 削除/引用 No.2702-1 - 2009/01/22 (木) 17:16:44 - miso これまでゲルシフトアッセイを行った事のない素人です。 蛍光ラベルしたDNA断片を用いたゲルシフトアッセイをされている方がいらっしゃればお教えください。 蛍光プライマーでラベルしたPCR産物（シス配列を含む）と相互作用タンパク質を混合したサンプルをNativePAGEしてから、ルミノイメージアナライザーで検出する方法を見つけたのですが、蛍光プライマーの価格が高いので、もう少し安くなる方法を探しています。 PCR産物を蛍光ラベルするキットを用いてゲルシフトを行った経験のあるかたがいらっしゃれば、お教え頂けないでしょうか？ 二本鎖DNAに蛍光ラベルしたNTPを取りこんだDNA（または、サイバーグリーンを用いた場合）では、転写因子との相互作用が阻害されたりしないのでしょうか？　5’端に蛍光ラベル出来るキットがあればと思うのですが、どのようなものがあるか分かりません。 イメージアナライザーの感度で検出かなど、経験が無いのでお教え頂けるとありがたいです。 宜しくお願いします。

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