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(無題) 削除/引用 No.2701-6 - 2009/01/23 (金) 23:24:12 - CJ そんなに張り付きますか…。条件そのものはとても標準的であることを考えると、容器に問題があるのでは？と思ってしまったり。 グリセロールが悪さするとは聞いたことがありません。

(無題) 削除/引用 No.2701-5 - 2009/01/23 (金) 15:25:10 - NUPD 早速のレスありがとうございます。 >CJ様 確かにDABの後に張り付くのですが 1次抗体処理後のリンスで軽く張り付くかな？ という感じで2次抗体後のリンスでさらに その感じがするようになり、DABでとどめといった感じです。 1次抗体、2次抗体に含まれるグリセロールあたりを 疑い始めてますがグリセロール(50％)で抗体保存は 普通にされてるので他の可能性も含めて試行錯誤中です。 1次抗体は購入時に入ってるのでどうしようもないのですが 2次抗体は保存期間が短くなりますが除けるので やってみてもいいかもと考えてますがいかがでしょうか？ ちなみに1次抗体、ブロッキングにはPBT/Azide 2次抗体にはPBTに希釈して反応させてます。 >染太郎様 1、普通のWTマウスです。 問題が解決できるまではメインのサンプルは 怖くて触れません。 2、プロトコール上リンスはPBSなのでそうしてましたが スライドに乗せる時にPBTを使って頑張って伸ばしてます。 ただ張り付いたものは回収できずかろうじてとれたものだけですが。 3、以前血清濃度を下げた時バックグラウンドが 非常に高くなり、シグナルが分かりにくくなったので プロトコール上の3％で最近はやる用にしてます。

(無題) 削除/引用 No.2701-4 - 2009/01/23 (金) 08:34:57 - CJ Tritonを加えるのは賛成ですが、ブロッキングをしない、というのはあまり同意できませんね…。レビュー時に文句を言われるかもしれませんよ。 あと、血清自体も表面張力を落とす印象がありますから、添加は悪い影響を与えないと思います。 私の場合、抗体のインキュベーション液は（他のトピにも書きましたが） PBS/1% normal serum/0.3% Triton-X/0.02% NaN3 です。なお、Tritonで細胞体染色が低下するような抗体では、Tritonを除いた液を利用しますが、正常血清が入っているせいか切片は張り付いたりしませんね。

(無題) 削除/引用 No.2701-3 - 2009/01/23 (金) 05:40:43 - 染太郎 １．染めようとしているのは普通のマウスでしょうか．自分はミエリンを形成しないミュータントの脳を染色したときに切片が粘着質で困ったことがあります（プラスチックの壁にくっつくほどではなかったですが）．もし特殊なマウスなのならwild-typeとも染め比べる必要があります． ２．私はいつもバッファーにはPBSではなく0.3% Triton X-100がはいったPBS-Tを使っています（DABのところだけはトリスです）．界面活性剤なので切片はくっつきにくくなります． ３．PBS-Tと適正な濃度の抗体やABC試薬（普通のスライド法よりも10倍ほど希釈できます）を使用すれば，私の経験ではブロッキングの血清は浮遊法には必要ないです．血清を使うとかえってバックグラウンドが上がり，切片が粘着質になってしまったことがあります．

(無題) 削除/引用 No.2701-2 - 2009/01/23 (金) 01:59:07 - CJ まず１点思いつくこと：DABはかなり粘着性が高いです。液量が少ないと壁面に張り付いたり、染色むらが起こったりします。また、セルストレイナーのようなものをウェルに入れて使用しているのだと思いますが、このようなものが入っていると振とうがうまく行きにくい印象があります。私は可能な限りこのようなネットを使用しないように心がけています。切片の移動は筆か、ガラス棒を伸ばしたものを使っています。 私の場合、ABCの洗浄までは２４ウェルを使用し、DAB反応時には、切片を５ｍｌDAB液（H2O2なし）を入れた６ウェルに入れて振とうしてDABになじませた後、微量のH2O2を入れて振とうさせながら反応をしています。反応時間は数分程度で、反応を常に観察しながら、時折実体顕微鏡で染色を確認し、適度なところで２％NaN3を投入して反応を停止、切片をPBSに移動させています。 解決の役に立つかわかりませんが、参考まで。

浮遊法で切片が回収できません 削除/引用 No.2701-1 - 2009/01/22 (木) 14:30:06 - NUPD いつも拝見、勉強させていただいてます。 最近マウスの脳のIHCを始めたのですが 最終的にDABで染色後、切片が底や壁に張り付き スライド上に回収できず困ってます。 簡単に書くと方法としては 灌流固定 4％PFAでpost-fixation, 4C, o/n 20％Sucrose に移し1〜2日(底に沈むまで) OCTに包埋後Cryostatで20umに薄切 sectionをPBS/Azideにとる PBSでrinse 10minx2 H2O2処理 blocking with 3%NGS, R/T, 1h 1st antibody 2nd antibody ABC DAB(キットの1/2倍濃度で長めに反応) Rinse後スライドに乗せ乾燥 *各ステップで切片の移動はセルストレイナーを用いる *各ステップ間でPBSでのRinse このDABの反応後に切片がセルストレイナーの 底や壁面に密着しはがれなくなってスライドが作れません。 ロッキングは継続的にしてますし、 壁面にも張り付くのでロッキング以前の問題かと思います。 感覚としては2次抗体の反応後のRinseの後あたりから 張り付きやすくなってきてるかなという感じはあります。 同じような経験のある方はおられますでしょうか？ プロトコールをいただいたラボのPIに相談したところ 切片が張り付くのは経験したことないとのことで いろいろ試しましたが結構行き詰ってきた感があります。 まだ少しずつ調整しているところですが もし何かいいアドバイス等ありましたら非常にありがたいです。 よろしくお願いします。

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