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(無題) 削除/引用 No.2692-11 - 2009/01/24 (土) 07:44:32 - PCR初心者 連続した投稿、申し訳ありません。 本日、注文した酵素(PrimeSTAR HS)が届いたので、それを使ってPCRを行ないました。 結果としては、一応バンドが検出できました。 ただ、予想サイズは300bp程度ですが、検出されたのは1.2kbpのはっきりとしたバンドと、あとそれ以上のサイズのいくつかのバンドでした。 今回の質問の趣旨である、両方のPrimerをビオチンラベルをしてしまうと、完全に機能しなくなるかと思っていたので、それに関しては、一応機能することが分かりました。 ただ、サイズは違うので、 設計の問題、サイクルの条件を含めて再度検討しなくてはなりません。 本当に皆様ありがとうございました。

ありがとうございます 削除/引用 No.2692-10 - 2009/01/23 (金) 11:41:00 - PCR初心者 ご回答ありがとうございました。 色々なご指摘ありがとうございました。 なにぶん、初めてやる実験のため、色々と参考になります。 ご指摘があった通り、酵素を変えてみることと並行して、クローニングをしてpcDNAを作成して、それを鋳型にしてのPCRも行ないたいと思います。 今回は誠にありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2692-9 - 2009/01/22 (木) 12:00:02 - ~ >その後このPCR産物を用いてシークエンスをして配列を確認し ラベル付きで増やしたい領域をカバーする領域を増幅することができているのですよね。 それを一度ベクターに入れてクローニングして、 それをテンプレートにしてラベル付きのプライマーで増幅してみてはいかがでしょうか。 ゲノムからの増幅と比べて、格段に増やしやすいはずです。 そんな配列を持っているのに、ゲノミックDNAをやるメリットは無いでしょう。 今ある手持ちの材料でできますよね。

(無題) 削除/引用 No.2692-8 - 2009/01/22 (木) 11:28:18 - AP その領域の配列の確認、別のプライマーではPCRがかかったことがある（二次構造の問題がない）ということは良しとして、 PCRが不調の場合、条件をいじるより、プライマーを変えてみるのが近道のことも多いです。配列が正しくてもかかりにくいプライマーというのもありますし、最悪の場合、配列に合成のミスやエラーがあって絶対無理ということもときどきあります。まずは、未修飾のプライマーをいくつかためして、PCRがかかると確認された配列であらためて修飾プライマーをオーダーしたらいいように思います。

http:// 削除/引用 No.2692-7 - 2009/01/22 (木) 10:09:50 - TK-1 > ただし、今回のご回答にて、ラベルの有無はPCRにそれほど影響しないと受け取れますので、みなさんのご指摘のとおり、酵素を変更した上で、再度条件検討を行なう予定です。 ラベルの有無はPCRにそれほど影響しないと受け取られるのは結構ですが、ラベル無しで動くかどうかもわからないプライマーに無駄金を使ってラベルを付けるという発想をもう少し考えた方がいいと思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.2692-6 - 2009/01/22 (木) 10:00:47 - PCR初心者 みなさん、ありがとうございます。 恥ずかしながら、今回と同様の配列部位に関しては、ラベルしていないPrimerでは試していません。 同じ遺伝子のプロモータ領域の配列にて非修飾のPrimerでPCRをおこない、目的のサイズのバンドが得られた経験はあります。 その後このPCR産物を用いてシークエンスをして配列を確認し、配列がデータベースに登録されているものとほぼ同じだったので、その配列を基にして、今回のラベルしたPrimerを設計しました。 ただし、今回のご回答にて、ラベルの有無はPCRにそれほど影響しないと受け取れますので、みなさんのご指摘のとおり、酵素を変更した上で、再度条件検討を行なう予定です。

(無題) 削除/引用 No.2692-5 - 2009/01/21 (水) 11:30:24 - AP 前段として、非修飾のプライマーで増幅された実績があるのでしょうか。あるいはその領域の配列はご自分の使っている材料で自前で決定した物でしょうか。修飾のためではなく単純に配列があっていない可能性もあるのでは。 非翻訳領域は塩基置換やトランスポゾンの挿入などの多型が多いので、データベースに登録されている配列をもとにプライマーを設計するとだめなことあります。

(無題) 削除/引用 No.2692-4 - 2009/01/21 (水) 10:37:42 - あべちゃん ~さんもおっしゃっていますが、プロモーター領域がGCリッチなものは結構あります。 わたしもp16という遺伝子のプロモーターがほしかったのですが、なかなか増やせず、困ったことがありました。 結局は、コスミドのライブラリーを購入して、そこから目的領域を得ました。 あるいは、メジャーな遺伝子ならば、他の研究室からレポーターベクターなど恵与してもらうなどの方法もあると思います。 あと、最近、人工合成遺伝子サービスがかなり安価になっているので、300ベースなら数万円で合成してくれる所もありますよ。その安い会社は納期に時間がかかりましたが・・・ 〜さんのおっしゃるように、個人的に、PrimeStarの成績は良いです。

(無題) 削除/引用 No.2692-3 - 2009/01/21 (水) 10:35:04 - おお どれもかからないというのがひっかかりますが、、、 ゲノムはどれ位の量使ってますが? 多すぎるとかえってかかりにくくなります。 10ng以下にしてください。 あとアニーリング温度をかえって上げると かかることもあります。 書いているサイクルの条件はそんなに悪いとは思えないです。

(無題) 削除/引用 No.2692-2 - 2009/01/21 (水) 10:25:26 - ~ ラベルしていないプライマーでも増えないのでしょうか？ 問題がラベルなのか、PCRの条件なのかが書かれている情報からでは分かりません。 プロモーターに限らず、PCRで増えないことはあります。 数bpずらして作り直すだけで、増える場合もありますし、 酵素を変えるだけで増える場合もあります。 私は酵素の失活は見たことがありません。 プロモーターはGC richな場合がありますので、それが関係しているのかもしれません。 Pfxは増えにくい酵素だと思います。 この掲示板で評価が高いのは、PrimeStarとLA-taqだと思います。 可能であれば、どちらか試してみてはいかがでしょうか。

ラベルしたPrimer 削除/引用 No.2692-1 - 2009/01/21 (水) 09:55:30 - PCR初心者 今ＰＣＲで完全にはまってしまっています。 5'側にラベルをしたPrimer(Upper, Lowerの両方）を使用して、PCRを行なっていますが、条件検討を何回も行なっていますが、アニーリング温度をTm値よりも10℃以上下げても、cycle数を40にしても、non-specific のバンドすら出ません。 テンプレートはgenomic DNAを用いて、Promoter領域の一部(300bp程度）を増幅しようとしていますが、別のサンプルを使っても全くバンドが出ません。 Promoter領域ではこのようなことが度々起こるのでしょうか?それとも、単なる酵素の失活や設計ミスが原因でしょうか? なにぶん、この領域でPCRを行なうのが初めてのため、どこまで条件検討を行なうべきか、悩んでいます。 ちなみに、酵素はTaqとPfxの両方で試し、アニーリング時間は30sec, extension 時間は1minで行なっています。 宜しくお願いします。

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