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ありがとうございました。 削除/引用 No.2691-6 - 2009/01/21 (水) 20:02:48 - パピプペポスドク みなさん、ありがとうございました。 やはり同じようなことがあるのですね。 今まで経験したことがなかったので、ビックリしてしまいました。 電荷も影響あるのでしょうけれど、同じマイナスをプラスに変える変異でも、泳動度が早くなったり遅くなったりという結果なのが不思議でした。 確かにリン酸化でも遅くなることが多いですし、SDSの結合度や立体構造の変化なども含めて色々なケースが考えられるということなのでしょうか？ 大変勉強になりました。 みなさんに大変感謝しております。

(無題) 削除/引用 No.2691-5 - 2009/01/21 (水) 14:27:15 - プラス電荷増加 実際に少し体系的にやったことがあります。 電荷をほぼ部位特異的に0、+１、+２にするとそれに応答して、SDS−PAGEでの移動度がバンドの厚さ分くらいそれぞれ明らかに遅くなりました。よって、１アミノ酸残基置換のプラス電荷増加によって蛋白に結合したSDSなどなどのマイナス電荷が中和され、移動度に影響を与えることはあるらしいです。また与えないこともあります。

(無題) 削除/引用 No.2691-4 - 2009/01/21 (水) 14:25:41 - 通りすがり ご存知とは思いますが、SDS-PAGEによる電気泳動について、 (過度に単純化された)理論ではタンパクは完全に直鎖状となり SDSの負電荷で泳動されることになっていますが、実際には高次 構造が残っているために泳動度が変わることがしばしばあるようです。 今回の場合に当てはまるかどうかわかりませんが、電荷の違いで 泳動度の違いが説明できるかどうか確かめたいところですね。。。 (過度に単純化された理論なら簡単に計算できそうに思います) 電荷の違いだけで説明できなければ、修飾や高次構造も(あるいは SDSとの結合能まで?)考慮する必要があるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2691-3 - 2009/01/21 (水) 10:44:18 - おお 6xHISを付加するだけで5-10kDa大きくなることもあれば、そのままの所に 電気えいどうされることもあります。 燐酸化されると、マイナス電荷が増えるのに、かなりのたんぱく質は 移動度がおそくなります。でも変わらないものもあります。 １塩基置換で移動度が変わることがあってもおかしくないと思いますが、 細胞に発現した系では、修飾パターン(別に置換したところでなくても) が変わることもあるので、総合的に見ていかないといけないかもしれません.

(無題) 削除/引用 No.2691-2 - 2009/01/21 (水) 10:06:48 - たいあ 経験あります。 私も一アミノ酸の置換で泳動度が変わりました。 マスしても修飾をうけてなさそうでした。 やはり電荷でしょうか。

一アミノ酸変異で泳動度が変化 削除/引用 No.2691-1 - 2009/01/21 (水) 09:38:30 - パピプペポスドク いつもお世話になっております。 Arfという small G-protein に ESADELQKMLQED という配列があり、その E or D を K に変えたところ、泳動度が+1kDa〜-1kDaの間で変化しました。 具体的に書きますと、E(-1)SAD(-1)E(-1)LQKMLQE(-0.5)D(+1) です。 しかも完全に１バンドでした。 このタンパク質は soluble protein で、今までに修飾はＮ末のミリストイル化しかしられていません。 タンパク質は COS に発現させたものを 56℃、20分で加熱処理し、泳動しました。 このような泳動度の変化には、どういった理由が考えられますでしょうか？

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