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有難うございました。 削除/引用 No.2686-12 - 2009/01/25 (日) 14:47:16 - ととと Ｏ様、Ｇ様有難うございました。 知りたい情報が詳しく分かり、非常に参考になりました。 siRNAのメーカーはambion、invitrogenで価格等検討して決めたいと思います。 Ｇ様 腹腔細胞に関して色々と教えていただき有難うございました。 実際の実験時には、教えていただいた情報を参考に条件検討を十分に行ってのぞみたいと思います。 うまくノックダウンしてくれるといいのですが。 赤血球に関しても、どの程度気を使うのかの目安が分かりました。 お忙しい中本当に有難うございました。 また、何かありましたら宜しくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.2686-11 - 2009/01/23 (金) 19:07:57 - G 細胞数に関しては、5x10^6 cells(6wellプレートの場合)くらいでやっています。 ただ、一度ご自分で検討した方がいいかもしれませんね。 あくまで参考程度で。 siRNAのメーカーですが、私はinvitrogenから販売されているstealth siRNAを購入してます。 off-targaet効果も弱いみたいです(とホームページには書いてあります)。stealth siRNAは3本セットで購入してますが、少なくとも3本中2本はノックダウンできています。あくまで私の経験ですが。 また、RNAiは48~72hr行っています。目的のタンパクによってノックダウンされる速度は異なると思いますので、私はいつも48~72hrで、どのタイミングで最も落ちているか検討しています。 腹腔マクロファージを採取する時、確かに赤血球がコンタミする場合がありますが、2hr培養してからのPBS washでほとんど除けますので、それほど気にしていません。(なるべくコンタミには気をつけていますが) また、マクロファージを採取してから12hr以内は、採取した時の刺激で何かしら活性化していると考えられますので、RNAiやアッセイは一晩培養してから行っています。 長々とすいません。

(無題) 削除/引用 No.2686-10 - 2009/01/23 (金) 14:32:57 - O siRNAの配列に関してですが、Ambionは一つの遺伝子に付き３つのsiRNAをpre-designedとして準備しているようで、その三つを一度に注文すれば全ての配列を教えてくれます。 他メーカーに関しては詳しくは知りませんが、siDirectという国内のバイオベンチャーメーカーは１配列から教えてくれるみたいです。合成料金も比較的安価です。多分、フナコシが窓口になっていると思います。

(無題) 削除/引用 No.2686-9 - 2009/01/23 (金) 09:55:07 - ととと Ｇ様 詳しい情報を有難うございます。 もし宜しければ、あと少し教えていただきたいのですが、 細胞の数はどの程度で行われていますか？ お使いのsiRNAのメーカーはどちらでしょうか？ （メーカーで違いはあるのでしょうか？） RNAi後は何日程培養されていますか？ 腹腔マクロファージを採取する際に赤血球が混入してしまう時があり、あまり多いとそれが刺激になりそうなので廃棄していますが、どの程度気にしていらっしゃいますか？ 細かい事で申し訳ありませんが、宜しくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.2686-8 - 2009/01/22 (木) 12:26:29 - G ととと様 使用したsiPORTはAmbionのsiPORT Amineです。NeoFXは使用したことがありません。 また、マウス腹腔から単離したマクロファージは、plateにまいて37度で2hr培養後、PBSで3回程washし、また培地置換して37度で一晩培養しています。siRNAをtransfectionするのは一晩培養してからです。回答になっているかわかりませんが。。。 私が使用したマクロファージは常在マクロファージだと思います。 RAW264.7でも条件を検討すれば、7~8割のノックダウンは可能だと思いますので、やってみても損はないのではないでしょうか。 残念ながら、肺胞マクロファージなど他のマクロファージは検討したことはないです。

(無題) 削除/引用 No.2686-7 - 2009/01/22 (木) 10:05:53 - ととと 皆様に色々とアドバイスをいただけて喜んでおります。 Ｇ様 腹腔マクロファージを扱っていらっしゃる方がいて、心強いです。 いくつか伺っても宜しいですか？ siPORTというのはAmbionのNeoFXでしょうか？ トランスフェクションの試薬をウェルに先に入れるリバーストランスフェクションで行うとHPに書いてあったのですが、マクロファージの単離（2-4時間接着させる）とのタイミングはどのようにされていますか？ また、このマクロファージは常在ですか浸出ですか？ RAW264.7も使用候補に入れていたのですが、cell lineの方が効率が悪いというのは意外でした。肺胞マクロファージも考えているのですが、他のマクロファージで試された事はありますか？ Ｏ様 AmbionのsiRNAは購入後でないと配列を教えてくれないとの事ですが、他のメーカーでも、設計してもらうsiRNAというのはそういうものなのでしょうか？ タカラなどもそのようですが。 プライマリー単離後の導入ポイントのお話は大変参考になりました。 以上、宜しくお願い致します。 また、まだまだアドバイスをいただける方がいらしゃいまいしたら、 宜しくお願い致します！

(無題) 削除/引用 No.2686-6 - 2009/01/21 (水) 20:39:46 - G 私たちはマウス腹腔マクロファージのRNAiにおいて、siPORTという試薬でかなりの効率で ノックダウンできていることを確認しています。 また、LipofectamineRNAiMAXでも、siRNA導入を2回行うことでノックダウンはできました。 (RNAiMAXの量はかなり使いましたが) 私の経験では、RAW264.7などの単球由来細胞株よりも、マウス腹腔から単離したマクロファージ のほうがノックダウン効率は良さそうです。

(無題) 削除/引用 No.2686-5 - 2009/01/21 (水) 18:38:57 - ＩＲＥＳ 初代培養マクロファージに導入するのはかなり困難だと思います。思いますというのは、分子生物学に精通している知人がかなり苦労をされていたので。結局ヌクレオフェクターによるEPで解析に可能な程度の導入効率を得たとのことでした。

(無題) 削除/引用 No.2686-4 - 2009/01/21 (水) 15:57:27 - O vitroのノックダウンなら詳しい方がたくさんいると思いますので、ありきたりな回答しか出せないと思います。済みません。 私も論文にはあまりなっていない細胞（プライマリー）でノックダウンをしています。プライマリーを用いる注意点としては、単離後の導入のベストポイントを見つけることがあると思います。細胞にもよりますが、単離して時間が経つと入らなくなるという話しを聞きますし、私の扱っている細胞でも単離後７２時間以降では導入効率、導入後の生存率が落ちました。 siRNAはambionのpre-designedを用いていますが、3本一度に買っています。というのも一種類だけでは仮に落ちたとしてもレフェリーに突っ込まれますし、ambionは３種類購入すると配列を教えてくれるので。当然ながら、negaconはきっちり取った方がいいですよ。ちなみにambionではnegaconのセットを販売していて、最もサイドエフェクトが低いネガコンを調べることが出来ます。導入試薬はsiRNAの販売元と同じ製品でなくても大丈夫ですが、とりあえず別のマクロファージの論文があるならそれを参考になさってみるのがいいのではないでしょうか？ RNAiは難しくはないですが、丁寧にプレ実験を行い、至適条件（細胞数、試薬濃度、siRNA濃度の関係等）を決めることがコツかと思います。

(無題) 削除/引用 No.2686-3 - 2009/01/21 (水) 13:47:44 - ととと Ｏ様 すみません。今回は腹腔から取り出した常在マクロファージに対して、in vitroでRNAiをしたいと考えております。 マウスのマクロファージ系のcell lineでは色々とやられていますが、腹腔マクロファージでの論文があまり見つかりません。 トランスフェクションの試薬としては、QIAGENのHiPerFectやRocheのX-treme GENE siRNA transfection reagentなど用いた論文を参考にしようかと思っています。 合成siRNAのメーカー、お勧めの方法、アドバイスがありましたら宜しくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.2686-2 - 2009/01/21 (水) 12:00:19 - O in vivo RNAiということでしょうか？ vivo, vitroに関わらず効率等は組織、細胞、siRNA、試薬によって全く異なると思いますので、詳細な予備実験が必要かと思います。 vivoなら通常グレードではなく、vivo用グレードのsiRNAをかなり大量に投与しないと落ちないとメーカーのセミナーで聞きました。トランスフェクションはvivo用試薬かエレクトロポーレーションでしょうか（組織によりますが）。または、medgelの生体内埋め込みようのゲルに浸透させて、移植とうのもありです（論文あります）。腹膜ならゲルを使うのがいいかも知れませんね。siRNAも少なくて済みそうですし。

腹腔マクロファージでRNAi 削除/引用 No.2686-1 - 2009/01/20 (火) 15:06:13 - ととと マウス腹腔マクロファージでRNAiを検討しています。 合成siRNAを用いる方法で行いたいのですが、どの程度の効率で入るものでしょうか？ 合成siRNAやトランスフェクション試薬のお勧めのメーカーについても、ご存知の方がいましたら教えて下さい。 RNAiは初めてなので、詳しく教えていただけると助かります。

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