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(無題) 削除/引用 No.2673-14 - 2009/01/21 (水) 23:52:55 - さっぽろ みなさんご助言ありがとうございます。 固定条件とブロッキング方法を再度検討してみます。

(無題) 削除/引用 No.2673-13 - 2009/01/21 (水) 11:17:14 - おお >[Re:12] ＩＲＥＳさんは書きました : > > 培養細胞での標的蛋白質の遺伝子発現は確認済みです。 > と書かれていますね。ただ、検出するに足る発現量か否かの問題があるかと思 >[Re:11] おおさんは書きました : > あの、それ、使っている細胞でも発現してますか、、、、 すいません。みおとしてました。

(無題) 削除/引用 No.2673-12 - 2009/01/21 (水) 10:13:19 - ＩＲＥＳ > 培養細胞での標的蛋白質の遺伝子発現は確認済みです。 と書かれていますね。ただ、検出するに足る発現量か否かの問題があるかと思いますが...こういう場合は陽性コントロールがないので、ターゲットタンパク質を高発現させた細胞を作製して、これを陽性コントロールとして検討するのが結果的に良い結果を生むと思います。

(無題) 削除/引用 No.2673-11 - 2009/01/20 (火) 08:27:16 - おお あの、それ、使っている細胞でも発現してますか、、、、

(無題) 削除/引用 No.2673-10 - 2009/01/20 (火) 04:52:31 - CJ ややわき道にずれますが、Jackson Immunoresearchの能書きによれば 「BSAはIgGをふくんでおり、牛IgGはヤギIgGと反応しうるのでBSAでのブロッキングはシグナルを弱めたりバックグランドを高めたりする。」 のでお勧めできんようです。ブロッキングに使う正常血清を変更することが薦められています。 私は培養細胞をやったことがないので大間違いかもしれませんが、皿に細胞を接着させる成分がぬってあるならば、BSAがそこに非特異的に大量に吸着し、１次抗体が殆どそっちに行ってしまうので、凍結切片で成功したのに対して培養細胞で失敗したのではないか？と考えたのですが。

(無題) 削除/引用 No.2673-9 - 2009/01/19 (月) 13:47:15 - AP >どれほども、分泌治されたタンパクが膜表面にあるとも思えないのですが、分泌経路によってはあり得るのでしょうか？ 分泌タンパク質といってもいろいろあるわけで、染まられる物も染めるのが困難なものもあるでしょうね。特に培養細胞でとなると、実例を余り知らないというのが正直なところです。 ただ、分泌タンパク質の免疫染色と聞いて、まず頭に浮かんだのはTGF-betaやFGFなど拡散性細胞間シグナルのような、発生分化関連の事例です。こういうのは細胞表面の糖鎖に親和性があり、分泌細胞の周辺で濃度が高い濃度勾配を作ります。うまいこと細胞表面に固定できれば可能かと思います（その点、糖とクロスリンクをつくるPLP固定が適しているかと）。

(無題) 削除/引用 No.2673-8 - 2009/01/19 (月) 10:23:45 - ＿ すみません。教えてください。 分泌タンパク質を染める場合、膜透過性処理をするとうまく染まらないと言うのは分かりますが、 何故、膜透過処理をしないのに染まるのでしょうか？ 細胞内に貯留しているタンパクは染まらない訳ですよね？ どれほども、分泌治されたタンパクが膜表面にあるとも思えないのですが、分泌経路によってはあり得るのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2673-7 - 2009/01/19 (月) 00:15:54 - さっぽろ AP様 再度ご回答頂きありがとうございます。 実は膜透過処理を始めたのには理由がありまして、この細胞を用いた別の免疫染色（これも分泌性蛋白質です）が膜透過無しでは鮮明な染色像が得られなかったためです。 膜透過無しのコントロールも用意して、もう一度最初にもどって再実験してみたいと思います。 膜透過にこだわりすぎて他が見えなくなっていたみたいです。 貴重な情報をありがとうございました。 固定によって保持されるとばかり考えていました。

(無題) 削除/引用 No.2673-5 - 2009/01/19 (月) 00:04:17 - AP 分泌タンパク質なら（細胞内の分泌小胞にあるのを狙うのでもない限り）、透化処理は必要ないばかりでなく、流出して失ってしまうでしょう。 組織切片なら固定によって細胞間のマトリックスなどとクロスリンクして保持されるかもしれませんが、培養細胞の場合、それは期待できません。細胞表面にうまく固定されれば可能かもしれませんが。 膜タンパク質や分泌タンパク質を標的にする場合、私はPLP固定をおすすめしています。

(無題) 削除/引用 No.2673-4 - 2009/01/18 (日) 23:37:09 - さっぽろ 回答ありがとうございます。 分泌蛋白質です。 この細胞の他の分泌性蛋白質を染色したときは4% PFA 1h,4℃で染まったので同条件にしてみたのですが固定法も考慮してみたいと思います。 貴重なご意見ありがとうございました。 補足ですが、 凍結組織切片では 一次抗体：400倍希釈 二次抗体：300倍希釈 です。 細胞では同条件で試しましたが染色を失敗したので 一次抗体：200倍希釈 二次抗体：200倍希釈 まで濃度を上げました。

(無題) 削除/引用 No.2673-2 - 2009/01/18 (日) 22:59:32 - AP >培養細胞は4%PFAで1h固定し、0.5% Triton-X100で15min 膜透過、2% BSAブロッキング 一般的に言って、培養細胞で一時間固定は長すぎでは？ ターゲットはどのようなタンパク質でしょうか？膜タンパク質や、分泌性タンパク質だと、固定法によっては、また透化処理で、抜けてしまって染まらないことが多いです。

培養細胞の免疫染色で染まりません（組織切片では染まる） 削除/引用 No.2673-1 - 2009/01/18 (日) 21:05:18 - さっぽろ 免疫染色初心者です。 培養細胞の免疫染色で苦戦しています。 使用抗体は 一次：Goat anti-☆ ポリクローナル抗体 二次：Alexa 555 標識　Chicken anti Goat IgG （なお、二次抗体にAlexa488を使わないのは別の抗体を組み合わせて多重染色を行う予定があるためです） この抗体（と、二次抗体の組み合わせ）での有効性は当ラボで凍結組織切片（4% PFA over night固定→スクロース置換）での免疫染色を行い確認しています。 培養細胞での標的蛋白質の遺伝子発現は確認済みです。 培養細胞は4%PFAで1h固定し、0.5% Triton-X100で15min 膜透過、2% BSAブロッキング、一次抗体 overnight 二次抗体 1h です。 -20℃メタノールでの膜透過も試しましたがダメです。 今後の対策としては膜透過の条件をもう少し変えてみたいと思っています。 他に考えられる理由は何でしょうか。 アドバイスあったら教えて下さい。よろしくお願いします。

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