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皆様ありがとうございました 削除/引用 No.2663-16 - 2009/01/25 (日) 15:05:24 - O fish様 これまた参考になるお話しをありがとうございます。 そういうこともあるんですね。 あるタンパクにフォーカスして詰めていく仕事を単独で行っているのは初めてなので、知識として何が必要なのか、どのように展開していくのがいいのか手探り状態でしたが、色々と参考になるご意見をいただけてだいぶ道が見えてきたように思います。 頑張って仕事を進めます。 ということで、とりあえずこのトピックはここで閉じようと思います。 皆様、どうもありがとうございました。

追加 削除/引用 No.2663-15 - 2009/01/23 (金) 21:45:00 - fish 実際に見られる分泌自身はタンパクの過剰発現に起因する僅かな漏出で、アーティファクトという結論でした。

(無題) 削除/引用 No.2663-14 - 2009/01/23 (金) 21:42:10 - fish 以前新規タンパクでモチーフ予測でシグナルシークエンスあり、GPI配列なし、ER retension signalなしのタンパクを扱ったことがあります。 当然分泌されるだろうと思い、tag-付き新規タンパクを過剰発現したところmedium中に分泌されていました。ところが、この分泌はER-Golgi分泌阻害薬であるbrefeldinAで全く分泌阻害されませんでした。(既知の分泌タンパクが完全に分泌阻害されている状況確認してます) 結局、理由は不明ですが、細胞膜画分に存在しており(density gradientと免疫染色にて)、分泌されていなことが分かりました。 参考になれば幸いです。

(無題) 削除/引用 No.2663-13 - 2009/01/23 (金) 14:45:18 - O 皆様参考になるご意見ありがとうございます。 おお様 プライマリーで多少細胞外にも出ていることが明らかなので、オルガネラ分画で局在を調べてもどこかしらで多少は出てきてしまうかも？という気はします。ただ、量的な比較（どこにどれだけ存在するという）は意味があると思うので、トライしてみようと思います。 ただ、ご指摘のように過剰発現系では局在がぶれて、正常状態をフォローしない気はしますね。刺激因子の存在でかなり大量に発現するタンパクなので、過剰発現系を用いることなく進めてみようと思います。 ありがとうございます。 タグ抗体様 ウェスタンで見る限り、データベース上でシグナルと言われているところが切れているであろうサイズで検出されますので、このタンパクに関してはプロセシングはされているのかなと。なので、おそらくERには行っていると思うのです。ただ、データベースはあくまで参考に、実際は様々な挙動を示す場合が想定されると言うことですよね。参考になりました。ありがとうございます。 ats様、DNAI様 そうなんですか。これは知りませんでした。 まだ新規と言っても差し支えないタンパクですので、色々なことを想定しながら実験を進めていきたいと思います。 大変役立つ情報でした。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.2663-12 - 2009/01/23 (金) 09:41:29 - DNAI atsさんと同意見です。 N-termの疎水性の高い領域は、分泌シグナルかトランスメンブレンか迷うことがあります。 情報が少ないターゲットに関しては注意が必要です。

II型膜タンパク 削除/引用 No.2663-11 - 2009/01/22 (木) 18:49:05 - ats II型膜タンパクに分類される、C末が細胞外に向いているタンパクもあります。

(無題) 削除/引用 No.2663-10 - 2009/01/22 (木) 03:14:50 - タグ抗体 >扱っているタンパクは分泌シグナル配列を持っているのですが、このようなタンパクは必ず細胞外に分泌されるのでしょうか？ いいえ。に訂正します。

(無題) 削除/引用 No.2663-9 - 2009/01/22 (木) 03:09:02 - タグ抗体 >扱っているタンパクは分泌シグナル配列を持っているのですが、このようなタンパクは必ず細胞外に分泌されるのでしょうか？ よくあることです。挙げられていない可能性としては、シグナルが切れないで、細胞外、内部に留まることです。細胞をタグ抗体などで染めたり、細胞分画で分かるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.2663-8 - 2009/01/21 (水) 23:52:07 - おお >[Re:7] Oさんは書きました : > おお様 > 局在をより詳細に調べるとして、細胞内、特にERで機能発現していると言うことをどのように示すのがいいのか、思案中です。 > 専門外になりますので、可能かどうか分からないのですが、 ERに厳格に引留められているようでしたら、ゴルジには 検出されないか、ゴルジのERよりのところまでしか 検出されない可能性もありますし、分泌小胞で検出されて いないなら、分泌には積極的でないと考えられる と思います。問題はいいマーカーがあるかと言う事 ですが、この辺は分かりません。 詳しいかたのフォローがあればいいですね。 このような例では過剰発現をすると、トランスポート 、局在化のシステムが機能しなくなり、どこにでも 発現するようになることがあるので少し注意が必要かもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2663-7 - 2009/01/21 (水) 09:35:24 - O 雑兵様 情報ありがとうございます。 C末の情報は手元にあり、一応このタンパクではそのような配列は持たないことが確認されていますが、参考にいたします。 おお様 局在を見るというのはオルガネラ分画で、ということですか？ ISH及び免染（組織＆細胞）での局在は確認しておりますが、免染像からはERが染まっているなぁという風に見受けられます。また、プライマリーカルチャーを行い、発現を高める刺激を与えてやると培養上清にも出てきますが（分泌はされてはいる）、発現量と比較すると分泌量が非常に少ないと思われるのです。 局在をより詳細に調べるとして、細胞内、特にERで機能発現していると言うことをどのように示すのがいいのか、思案中です。 名無し様 分泌タンパクである、との定義はN末リーダー配列の有無で表されていると思います（私も以前からの専門ではないので的確にはお答えできないと思いますが）。 ただ、このスレッドでおお様も書いて下さっているように、タンパクによってはスタートコドンが変わる場合があり、そうすると行き先が変わることもあるようです。 今のところN末リーダー配列を持ち、ゴルジで糖鎖修飾を受けないなら細胞外へ分泌されると考えるべきなのかも知れませんが、細胞によってあるいはタンパクによって微妙に異なる場合も多々あるのではないかと、実験と通して感じています。 あまり、参考にならずに済みません。

(無題) 削除/引用 No.2663-6 - 2009/01/17 (土) 06:52:12 - 名無し 向学のために教えて下さい。分泌シグナルというのはアミノ酸配列から予測されるということでよろしいのでしょうか。つまりそういった配列あったとしても必ずしもすべてが分泌される蛋白質とはかぎらないという見方をしていたほうがよいのでしょうか。よく翻訳後修飾などでコンセンサス配列とかがありますが、個別のケースでは実験してみるとそういった配列が必ずしも修飾部位でないことはしばしばあるので、同じようにかんがたほうがいいのかなあとおもいお聞きします。

(無題) 削除/引用 No.2663-5 - 2009/01/17 (土) 01:05:09 - おお まずは局在をみてみればいいのではないかと。とくに過剰発現してない 状況で。 ターゲットの遺伝子が分かっているなら、きょう局在もみたほうが いいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2663-4 - 2009/01/16 (金) 18:38:49 - 雑兵 ERに滞留する一群のタンパク質のＣ末端に見られるER retention signalという配列モチーフもありますよ。 http://ja.wikipedia.org/wiki/%E3%82%B4%E3%83%AB%E3%82%B8%E4%BD%93

(無題) 削除/引用 No.2663-3 - 2009/01/16 (金) 17:37:10 - O おお様 早速ありがとうございます。 スタートコドンの位置取り？の変化で移行先が変わるのは他にはカテプシンLかと。文献を読んだ記憶があります。 シャペロンタンパクのお話しは参考になります。早速文献を当たってみます。扱っているものはシャペロンではありませんが、別のタンパクと結合して性質を変えていると言うデータが得られているのですが、それがどう考えても（色々な実験を行ってみた結果です）細胞内での現象だろうと思われるのです。 私もERに移行していることは反対しませんが、大半はそこにとどまっているように思えるので、ERが主な機能発現場所であることを証明したいと思っています。 何かいい案がございましたらご示唆下さい。

(無題) 削除/引用 No.2663-2 - 2009/01/16 (金) 16:47:44 - おお ありえそうなはなしかと、、、 確かかテプしンはリソソームに局在する物がありますが、膜のリサイクルや分泌がさかんになると 細胞外にも分泌されるようです。 BIPなどのシャペロ二ンはたしか、ER内に放出されますが、分泌よりも、ER内でのタンパクのフォールディングに関与しています。PDIもそうかなたしか、、、 分泌シグナルというよりはシグナルペプチドが存在するので、ER内に送り込まれると言う事でないでしょうか。 あと珍しい例としてFGFはスプライシングやトランスクリプションのスタート位置によって、分泌シグナルがないアイソフォームができ、核内に移行するという話がありますね。もうひとつそれに似た話がありましたが、、、、具体的なタンパクの名前はおもいだせません。 あとイーストで同じ遺伝子産物が核内と細胞外で見つかっている例もあったと思います。

シグナルがあっても分泌されない？ 削除/引用 No.2663-1 - 2009/01/16 (金) 16:04:14 - O 扱っているタンパクは分泌シグナル配列を持っているのですが、このようなタンパクは必ず細胞外に分泌されるのでしょうか？ 実験上、細胞内で機能しているとしか考えられないデータが取れており、今後の実験の方向性に悩んでいます（共同研究者とも揉めています）。 ちなみに、分泌はされていることはされていますが、細胞外での挙動は不明ですし、レセプターも今のところ無いとされています。 例えば、ERに移行してプロセシングを受けた後にそのままERや細胞内のvesicle等で機能すると言うことはありえないのでしょうか？

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