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(無題) 削除/引用 No.266-10 - 2007/10/19 (金) 14:39:52 - カナマイシン 成功しました！　御礼遅くなってすみません。 いちおう成功した条件を書きます･･･ ・TakaraのPrimeStarを使いました。 ・メガプライマー法と通常プライマー法の両方でうまくいきました。配列確認済み。 ・QC反応は18サイクル、２ステップPCRです。 ・メガプライマー（280 bp）の量は、6 ng, 25 ng, 100 ng あたり（適当）で試しましたが、 　どれでも相当数のコロニーが取れました。 　コロニーPCRの結果から見るとぱっと見は少ない方が導入成功率が高そうでしたが、 　誤差の範囲かもしれません。 ・鋳型量はいまのところ振っていません。100 ngを用いました。今度振ってみようかな。 みなさまどうもありがとうございました！ 関連する質問を http://www.kenkyuu.net/cgi-biotech2/biotechforum.cgi?mode=view;Code=358 にさせていただきましたので、よろしければこちらもご指示を頂けると幸いです。

(無題) 削除/引用 No.266-9 - 2007/10/03 (水) 16:29:23 - カナマイシン >ats様 ありがとうございます。 なら、サーマルサイクルがうまく動いているかの確認なら サイクル数を増やして泳動して確認してみてもいいわけですね。

(無題) 削除/引用 No.266-8 - 2007/10/03 (水) 14:19:49 - ats > これで十分トランスフォーメーションして入る量になるし、 > サイクル数を増やすと無用な変異が入る可能性が増えるから、 私もそう思います。（エラそうですいません）鋳型の量によっては飽和するでしょうし。

(無題) 削除/引用 No.266-7 - 2007/10/03 (水) 14:12:16 - カナマイシン 済マークを入れてしまってからで申し訳ないですが･･･ QCの説明書にはサーマルサイクルのサイクル数をかなり絞って書いてあります（12-18サイクル）。 これって何のためですかね？ これで十分トランスフォーメーションして入る量になるし、 サイクル数を増やすと無用な変異が入る可能性が増えるから、という 発想なのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.266-6 - 2007/10/03 (水) 14:08:19 - カナマイシン >皆様 使い慣れている酵素で良いわけですね。当方はTakaraびいきなので、PrimeStarで試してみます。 a様がLA-taqを使われている、ということはTaq / 非Taqも問わないのですね。 >ats様 制限酵素サイト導入ですか。とてもスマートですね。 しかし、目的の部分以外、特に端に近いところを勝手に変えてしまうと アニールがうまくいかないのでは、と思っていたのですがそうでもないでしょうか？ 以前同僚がQCを試した際、 「コロニー拾って配列読んだらプライマーに相当する配列がダブって入っていた」 と嘆いていたことがあり、あ、アニールがうまくいかなかったんだな、と 思った経験がありまして、警戒してました。 メガプライマーの方法ならかなりうまくいきそうですね。ありがとうございます。 >a様 こまかな条件を教えていただき感謝いたします。 細胞工学ですか。隙を見て図書館で探してみます。 >air様 QuikChange Multi Site Directed Mutagenesis、サイトで情報を見ました。 すごい！、というか不思議ですね･･･ ssDNAでトラホできちゃうわけですよね？　通常は入らないですよね？ これは「ブレンド酵素」に秘密があるわけですか？　にわかに信じがたい。 そして価格がアカデミック版ならただのQCとほとんど変わらないのも信じがたい。 試してみるかもしれません。実はかなりたくさん変異を入れたいので･･･ 有用な情報をありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.266-5 - 2007/10/02 (火) 16:43:43 - カナマイシン 取り急ぎ。 皆様、ご回答ありがとうございます。 結局、dNTPの質も量も普段通りで構わない、ということでよろしそうですね。 サイクル数少ないので少なめかな、と思っていたのですが。 個別のコメント＆御礼は後ほどさせていただきます。とにかくありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.266-4 - 2007/10/02 (火) 13:41:25 - air カナマイシンさんに同じですね。PfuよりKODplusの方がコンスタントに増やしてくれます。私も最初、StratageneのQCのキットが大昔、出たとき、一度だけ敬意を表して買いましたが、全く普通の長いPCRで良いので、以来、他のを使ってきました。普通のdNTPで全く問題ありません。 ただ、KODplusはPfuよりは良いですが、長いベクターの場合、コロニー数がかなり寂しくなることがあります。その場合、現在でも昔から愛用してる、RocheのHigh Fidelity PCR システムを使ってます。fidelityはKODplus程は高くないですが、問題になるレベルではないですし、気になるなら、複数個拾えばいいし。また、このbufferの方が、KODplusのbufferよりもKODplusを使うときでも、mutationの効率が高くなります。 ただ、stratageneのために言っておくと、multimutationが可能なQuikChange Multi Site Directed Mutagenesisは素晴らしいです。高いですがスケールを下げれば節約できるし。3カ所くらいまでなら一度に変異を入れることができます。primerは片方だけですむし。これを他の酵素のミックスで置き換えるにはそれなりに労力が必要でしょう。

(無題) 削除/引用 No.266-3 - 2007/10/02 (火) 13:22:58 - a 私はLA-Taqで行っています。atsさんが書かれたように、PCR産物（200bpくらい）をmega-primerにして行っています。プライマー量は通常のPCRより減らして（1/5程度）、15サイクルは通常のPCR、その後20サイクルは2step PCRでやっていました。DpnI処理はエタ沈してから行っていました（エタ沈は必要ないかもしれませんが） あと、数ヶ月前の細胞工学か実験医学に異なった方法のsite-directed mutagenesisが書いてありました。 参考になれば

(無題) 削除/引用 No.266-2 - 2007/10/02 (火) 11:30:14 - ats pfuは増幅効率が悪い経験があるので、東洋紡のKODplusを使っています。 KODplusのbufferでもDpnIは活性があります。 Kitもあったような？ MutantがWTと区別できるように多少周りの配列も変えて（もちろんsilent mutationで)制限酵素部位の有(無)を導入すると、screeningが楽です。 これを行いたくない場合は、target primerと別個のprimer（制限酵素部位を潰す）でのPCR産物をmega-primerとして使う方法もあります。 でも最近は、手間だけどクロ−ン化しなすことが多いなあ。

QuickChange を用いた Site-directed mutagenesis のdNTP 削除/引用 No.266-1 - 2007/10/02 (火) 10:31:12 - カナマイシン いつもお世話になっております。 古いフォーラムの方に関連した話題があったのですが、 こちらで新規に立てさせていただきます。 現在、ストラタジーン社の QuickChange site-directed mutagenesis kit を用いて Site-directed mutagenesis を行おうと思っています。 キットといっても中身はコントロール用品が主なので、 今後は酵素等を個別に買ってコストを抑えるつもりです。 具体的には、増幅酵素であるPfuとそのバッファー、それから制限酵素DpnIを買えばOK･･･ と思っていたのですが･･･ マニュアルに、 『キットに入っているdNTP mixtureはmutagenesis用に最適化されたものです』と 書いてあるのを見つけました。濃度すら書いてない（1 ul入れろ、の指定）ので困っています。 個別に酵素を買われて成功されている方、どんなdNTPをどのくらいの量で使われていますか？ また、増幅酵素についてもPfu以外にこれで成功した、という例がありましたら ご教授いただければ幸いです。

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