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解決 削除/引用 No.2656-14 - 2009/01/24 (土) 23:51:13 - RH 結局DMSでCrosslinkして作ったグルタチオンーGST誘導タンパク質ビーズでうまく行きました。 無事バンド切り出してMSにかけています。 皆さんコメント有難うございました。

(無題) 削除/引用 No.2656-13 - 2009/01/17 (土) 12:38:12 - おお >[Re:12] 2123さんは書きました : > 例えば1-1.5MのNaClで溶出しないタンパク質でも1-1.5MのMgCl2で溶出で来たりします。 Mg++はカオトロピックな作用ががります。比較的マイルドで変性作用が 強くないので、抗体をカラムにクロスリンクした、アフィニティー カラムの溶出で使われることがあります。カラムは抗体によっては 再利用できます。この時使うMg++の濃度は3.5M位だったりしますが、 1.5Mでもそれなりに効果があるかもしれませんね。Li+も同様の 作用があります。SCN-はカオトロピックアニオンなのでLi+と 組み合わせて使うということもあるようです。 Nラウリルサルコシルは強いでタージェンとだと思いますが、GST には影響が少なくGSHカラムを使った精製で使われたりします。 だた、これで洗ってターゲットを溶出できたとしても、 若干はGSTタグのタンパクは遊離しそうなきがしますね。 一層のことGST-タグのたんぱく質と一緒に落としてきて 2Dしてゲルから分析というのがいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2656-12 - 2009/01/17 (土) 12:19:56 - 2123 免疫沈降さん＝GSTさんでしょうか？ そうと仮定して >[Re:10] 免疫沈降さんは書きました : > 高濃度の塩で溶出するというのはやったことが無いのですが、少なくとも細胞抽出液中ではAとBの結合は0.5Mの塩にも耐性でした。 > GSTとグルタチオンの結合はどの程度の塩に耐えるものなのでしょうか？ 例えば1-1.5MのNaClで溶出しないタンパク質でも1-1.5MのMgCl2で溶出で来たりします。 （不勉強で正確では有りませんが）逆もあるんじゃないかな？ これより高い濃度はGSTとビーズの結合がさらに外れてしまいそうです。 （実際の経験として1Mより1.5MのNaClの方がGSTがビーズから外れてしまいました） 私の場合、1M程度のNaCl,MgCl2で目的のタンパク質が完全に溶出され、 一方で5％程度のGST-Xが溶出されてしまいました。 これが質問者様に取って多いのか少ないのかはわかりません。 > > あとこれは単純な疑問なのですが、高濃度の塩はゲルを流す時に影響はしないものですか？ そのまま流せば泳動が乱れるでしょう。 ただ溶出後にTCA沈殿ーアセトン（又はエタノール等）でwashすれば塩は除けます。 この過程で濃縮も出来ますし。 今思ったのですが、もし結合領域まで既にわかっているのであれば ペプチド合成して競合させるとか。 まぁクロスリンクに比べると利点が少なそうですが。

(無題) 削除/引用 No.2656-11 - 2009/01/16 (金) 13:50:18 - 〜 Cさんの書いているやり方を応用したkitがPierceからでています（GST-Orientation Kit)。 私はこのkitは使いませんでしたが、試薬を自作し、kit のprotocolと全く同じ方法でやりましたら非常にうまくいきました。pull down後、sample bufferで溶出しましたが、CBBレベルではGST fusion蛋白自体は全くみえません。

(無題) 削除/引用 No.2656-10 - 2009/01/16 (金) 12:06:29 - 免疫沈降 高濃度の塩で溶出するというのはやったことが無いのですが、少なくとも細胞抽出液中ではAとBの結合は0.5Mの塩にも耐性でした。 GSTとグルタチオンの結合はどの程度の塩に耐えるものなのでしょうか？ あとこれは単純な疑問なのですが、高濃度の塩はゲルを流す時に影響はしないものですか？ GSTの切断ですが、AはBよりも大きいので難しいかもしれません。。。

(無題) 削除/引用 No.2656-9 - 2009/01/16 (金) 12:04:59 - f GST constructがpGEXの類で、 ゲル上のバンド位置さえ変わればBが見えそうなら タグ部分をプロテアーゼで切って溶出とかは？ 目的のBにサイトが無い前提ですけど。

(無題) 削除/引用 No.2656-8 - 2009/01/16 (金) 10:46:20 - 2123 確かにクロスリンクによって結合部位の構造が変化してしまう可能性はやってみないとわかりませんね。 でUreaの溶出に関する作用機序を存じ上げないので的外れな回答をしてしまうかも知れませんが、 単純にNaClを使う（濃度をあげる）、またはMgCl2を使うというのは駄目でしょうか？ 多少、GST-Aもリークしてしまうとは思いますが、loading bufferよりはましでしょう。 もちろんBが外れてくれればですが。 そもそもUreaでの溶出の際はAやBはどこにいるのでしょう？ 溶出されてる？orまだビーズ？ またGST-A、A、Bの分子量いかんでは（つまりB>Aならば）GSTの下流にある配列を認識するトロンビン、FactorXaなどを使うという手も。まぁこれも必ずしもGSTの後ろだけで切ってくれるとも限りませんが。

(無題) 削除/引用 No.2656-7 - 2009/01/16 (金) 05:42:30 - C クロスリンクさせるにはクロスリンクさせるもの同士が一定の距離以内にある必要（うまくいえませんが、抗原抗体反応とか蛋白質複合体とか結合すべくして結合している意味のある結合というかそういうもの）があり、ただ単にそばにある分子同士がランダムにくっつくということではないそうです。これはクロスリンカーの腕の長さに依存すると思いますがDMPはそんなに大きいものではないのであまり心配ないと思います。心配されているような問題が起こりやすければこんなに汎用されていないとおもいますし。 ただ原理を考えると分かるようにクロスリンク試薬はたとえばリジンなどの特定のアミノ酸残基を修飾する試薬なわけで、こうした修飾がインターラクションに影響を与える部位に運悪く多く起こると問題が生じる可能性も否定はできません。これはやってみないと分かりませんが、幸いそういうトラブルは経験ありません。

(無題) 削除/引用 No.2656-6 - 2009/01/16 (金) 05:06:05 - GST 書いているうちにコメントいただいていました＾＾； 有難うございます。

(無題) 削除/引用 No.2656-5 - 2009/01/16 (金) 05:02:44 - GST コメント有難うございます。 まさにaffigelは使ってみてはいるのですが、どうも結合性が極端に落ちてしまい条件を検討しているところです。 グルタチオンと違いランダムにビーズに結合してしまうためなのかと思っているのですが。 グルタチオンよりもかなり大量にタンパク質を結合させればうまく行くのかなとタンパク質を作成中です。 Cさんのクロスリンカーも考えたのですが、タンパク質A同士が結合することで結合性が失われないかと思ったのですが。 ご経験がおありでしたら是非教えてください。

(無題) 削除/引用 No.2656-4 - 2009/01/16 (金) 04:48:08 - C これは、かなり以前に大学の隣の研究室のA君に教えてもらいました。うちらの周りではリコンビナント蛋白質で抗原カラムを作るときなどに楽なので時々使われてました。ただなんでもそうですが100%は共有結合しないので、作ったあとに少し強めの条件で洗わないと溶出のときコバレントにくっつきそこなったGST-蛋白質がどうしてもすこしコンタミしてきます。でも、それでもいまよりはずっと少ないはずですから別に問題でなければしなくてもいいとおもいますが、嫌ならそのようにして洗って下さい。この場合、変な感じで変性してインターラクショんに影響することが少し心配ですが。GST部分にアフィニティーがあるものもあるかもしれないのでコントロールとしてGSTだけのカラムもつくっておなじようにやらないといけないと思います。 方法は下記の論文に書いてあります。　 A method for isolation and purification of specific antibodies to a protein fused to the GST. Bar-Peled M, Raikhel NV Anal Biochem 241 140-2 1996

(無題) 削除/引用 No.2656-3 - 2009/01/15 (木) 23:27:23 - おお まあ、仕方がないというか当然そうなる可能性は 充分あっただろうにという感じはします。 たんぱく質がゲルに固定できる、ゲル担たい を売っていると思います。バイオラッド あふぃゲルとか、そのたGEなどもその手の ものは扱っていると思います。 ですから、GSTカラムから溶出してそのような ゲルにこバレンとに結合させアフィ二ティー カラムを作れば良いかと思います。 結構簡単にできます。適切なバッファーで インキュベートするだけですので。 Cさまにうかがいたいのですが、GSHカラムへの固定は その方法論で実績があるのでしょうか。GSHにアミンは ありますのでクロスリンカーのターゲット部位はあり そうですが。

(無題) 削除/引用 No.2656-2 - 2009/01/15 (木) 13:03:04 - C 抗体をprotein Aに結合させるのと同じ方法（DMPを使う方法）でGST-fusion proteinをGSHカラムに共有結合すればいいと思います。

GST PDからGST付きたんぱく質をなるべく落としてこない抽出法 削除/引用 No.2656-1 - 2009/01/15 (木) 12:58:46 - GST いつも参考にさせていただいています。 GST-tagの付いたタンパク質Aをグルタチオンビーズに結合させて、クロマトグラフィーである程度精製したタンパク質とincubateして、Aと結合するタンパク質BをPullDownしました。 loading bufferで抽出してゲルに流し、GelCodeで染色してバンドを切り出し、MSにかけてBのmodificationを調べたいのですが、タンパク質A（とそのフラグメント）が大量に溶出してきてしまい困っています。 Beadsの量を減らす、２M Ureaで溶出など試みたのですが、うまくBのバンドを得ることができません。 GST-Aをなるべく溶出しないで結合しているBだけを溶出するような方法のアイデアを教えていただけないでしょうか？ 宜しくお願いいたします。

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