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(無題) 削除/引用 No.2651-2 - 2009/01/14 (水) 18:18:46 - AP ゲルには濃度によって分離能がある適正な分子量の範囲があり、それより小さい、あるいは大きい分子は、ほとんど移動度が変わらないです。 普段使う1%くらいのアガロースでは12 kbのマーカーと同じくらいに見えているかもしれません。 100 kbくらいまでならアガロース濃度を0.3%程度にすれば分離できますが、それ以上だとパルスフィールドでも使わないと無理です。 また、BACもsuperhelixになっていると思うので、制限酵素で切って線形化しないとサイズはでません。 とりあえず、ベクターが複雑に切断されない、適当な制限酵素で切って低濃度のアガロースゲルで分離してみるといいでしょう。サイズマーカーは通常使う物以外に、ラムダDNA（約50 kb）やそれをligaseで重合したラダー、ラムダHindIII（最長が約23 kb）などを流すといいと思います。 全バンド長の合計で、BACのサイズを出すことができるでしょう。 なお、BACは不安定で維持・増殖中に欠失を起こすこともまれではありません。 実際にサイズが小さくなっている場合はその可能性があります。

FISHのプローブ作製の際のBACの評価について 削除/引用 No.2651-1 - 2009/01/14 (水) 16:36:58 - nata 現在FISHを行おうとBACクローンを購入(invitrogen)しLB培地で増殖を行い、アルカリミニプレップ法にてプラスミドの精製を行っております。 精製後にプラスミドを確認しようと電気泳動を行うと12Kb付近にバンドが出現します。購入したBACのベクターはpBACe3.6と書かれており、ベクター自体がほぼ12kbあるようでインサートが存在しているかどうかの評価法が見つけられずにいます。 手技的に気を付けなければならないことを知らずにベクターを壊しているのか、それとも採取しているサンプル数が少ないのか（現在は大体20から30のコロニーを採取しLB培地液に入れ増やしています）現在、手中にある資料では調べられずにいます。 非常に初歩的な質問かもしれませんがどうかみなさまのお知恵を拝借できましたらと投稿させていただきました。 どうかよろしくお願いいたします。

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