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転写因子の競合阻害を証明する方法について トピック削除
No.265-TOPIC - 2007/10/01 (月) 20:14:27 - スターリングラード
ややこしい話で申し訳ございません。
同じ遺伝子のプロモータ上において、転写因子AのDNA結合部位と、転写因子BのDNA結合部位が非常に近接している場合(5baseしか離れていません）に、これら転写因子A,Bが互いにDNA結合に際し競合阻害している、すなわち、転写因子BがDNA結合することで転写因子AがDNA結合できなくなりAによる転写が阻害されることを示したいのです。
現在EMSAで、A,Bの結合部位を含むoligoを作成し、転写因子Aを含むcell lysateとDNA oligoを反応させ形成されたshifted bandが、転写因子Bを含む他のcell lysateをいれることで減弱しないかどうかをみていますが、転写因子A,Bが殆ど同じ分子量であるためか、shifted bandが同じ高さにでてしまい、区別がつきにくくなっています。
　ほかに(EMSAのほかに）証明する方法はありますでしょうか。
　ご教示御願い致します。
　
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あと 削除/引用
No.265-4 - 2007/10/02 (火) 09:52:05 - カナマイシン
A, B はアクチベーターですか？　リプレッサーですか？
見る限りではAはアクチベーターでありそうですね。B は？
B の役割にもよりますが、In vitro 転写なんかどうでしょう？
すいません思いつきを並べて。

(無題) 削除/引用
No.265-3 - 2007/10/02 (火) 09:47:07 - カナマイシン
私も抗体でスーパーシフトに一票。抗体があるといいんですが。

簡便には、泳動条件、特にEMSAのゲル組成を変える（TAE, TBE, TGEとか）ことで
泳動度に差が見えるかも？　運が良ければですけれども。

あとは･･･面倒ですけど濃度比を調整してDNaseIフットプリンティングとか･･･

(無題) 削除/引用
No.265-2 - 2007/10/01 (月) 20:22:50 - ヴォルゴグラード
どちらかの転写因子に対する抗体を加えてスーパーシフトを見るというのは？

転写因子の競合阻害を証明する方法について 削除/引用
No.265-1 - 2007/10/01 (月) 20:14:27 - スターリングラード
ややこしい話で申し訳ございません。
同じ遺伝子のプロモータ上において、転写因子AのDNA結合部位と、転写因子BのDNA結合部位が非常に近接している場合(5baseしか離れていません）に、これら転写因子A,Bが互いにDNA結合に際し競合阻害している、すなわち、転写因子BがDNA結合することで転写因子AがDNA結合できなくなりAによる転写が阻害されることを示したいのです。
現在EMSAで、A,Bの結合部位を含むoligoを作成し、転写因子Aを含むcell lysateとDNA oligoを反応させ形成されたshifted bandが、転写因子Bを含む他のcell lysateをいれることで減弱しないかどうかをみていますが、転写因子A,Bが殆ど同じ分子量であるためか、shifted bandが同じ高さにでてしまい、区別がつきにくくなっています。
　ほかに(EMSAのほかに）証明する方法はありますでしょうか。
　ご教示御願い致します。
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