全10件 ( 1 〜 10 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

imageJの扱い方 削除/引用 No.2636-10 - 2011/01/11 (火) 15:29:13 - sugar imageJでサザンブロッティングで得られたDNAの長さを解析したいのですが、 どうやって定量するのか分からずに困っています。 どなたかご存知でしたらご教授いただけないでしょうか？ どうかよろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.2636-9 - 2009/01/14 (水) 16:34:35 - 核酸初心者 Tさん 再三の質問に対し丁寧に答えていただき感謝しています． 御教授いただいたことを元に再度条件の検討を行います． パスの設定していなかったので解決と表示できませんが， とりあえず解決にしておきたいと思います． でも，何かしらの情報や実際に実験された方の意見などありましたら，どの様なことでもよいので御教授下さい．

(無題) 削除/引用 No.2636-8 - 2009/01/14 (水) 13:09:40 - T 私が言っているのは単純なことで、「太すぎるバンドでは量の評価はできませんよ」ということです。 real time PCR のように蛍光をダイレクトに測る場合と、エチブロで染めたゲルを写真撮影して画像化したものでは、シグナルのダイナミックレンジが異なります。ゲルの写真撮影の場合、バンドが少し太くなるとシグナルがすぐ saturate して、lineality が失われます。なので、linear な部分で評価しないと定量的には意味がないですよ、と言っているのです。 当然ながら、サイクル数が増えるほどバンドは太くなります。あらかじめ標準曲線を描いてダイナミックレンジを決めておき、そのレンジから外れるものについては、泳動前にレンジに入るようにサンプルを希釈する必要があります。例えば各ステップで 10ul づつサンプリングするとして、10 サイクル目で取ったものはそのまま 10ul 全量を流せば丁度いいかもしれませんが、20 サイクル目だと 10ul 流して出るバンドは太すぎるので、2ul を流して計測し、その値を５倍して評価する、というような事です。 テンプレート量との相関については、同一のテンプレートを様々に希釈したものを使って PCR をかけ、ゲルの写真撮影で評価した DNA 量と正しく比例するか確認する必要があるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.2636-7 - 2009/01/14 (水) 11:27:37 - 核酸初心者 Tさん，度々のご返答を頂き本当にありがとうございます． > いや、理想的には各点で採取したサンプルを、全量の 1/2, 1/4, 1/8 等に分けて流し、適当な濃さのバンドが出るところを採用するべきです。テンプレートの量とプロダクトの量が正比例するとは限りません。 サンプルに含まれるテンプレートの量を調べておかなければいけないということですね．これを元に適当な希釈率を出して，その希釈率におけるサイクル数をふったカーブを見ればよいということだと思われますが，解釈が違っていますか? 話はずれますが，real time PCRなどでは含まれる鋳型量に対してカーブの立ち上がりが早くなる，または遅くなるとだけ思っていたもので，そこから初期の鋳型量はターゲット遺伝子の発現量を反映しているものと考えていました．なので，サンプル間（RT product）の希釈率を同じにしておけば一応の評価ができるのだと思いこんでました．う〜ん，やっぱりこの手の分野ではまだまだ勉強が足りないですね，いや，単に理解力の問題かも・・・ トピの本旨からずれてきてますが，今しばらくこの無学者におつきあい願えれば幸いです．よろしくお願いします．

(無題) 削除/引用 No.2636-6 - 2009/01/13 (火) 22:56:02 - T > これは，テンプレートの量を変えてPCRにかけると理解したらよろしいですか? いや、理想的には各点で採取したサンプルを、全量の 1/2, 1/4, 1/8 等に分けて流し、適当な濃さのバンドが出るところを採用するべきです。テンプレートの量とプロダクトの量が正比例するとは限りません。

(無題) 削除/引用 No.2636-5 - 2009/01/13 (火) 21:33:51 - 核酸初心者 再度の返答，ありがとうございます． >[Re:4] Tさんは書きました : >それから PCR サンプルの希釈系列を泳動し、直線部分に乗る範囲を使ってデータにすれば、ある程度信頼できる数値が得られるでしょう。 これは，テンプレートの量を変えてPCRにかけると理解したらよろしいですか?イラストレイテッドにものっていることと同様のことを仰るっていると思いますので． > > バックグラウンドを除去するにはどの様な手順で行えばいいのでしょうか?また，このバックグラウンドとはアガロースゲルの適当な部分の輝度ということでしょうか? > > そうなります。簡便には、サンプルを乗せていないレーンで、DNA バンドと同じような高さの位置から、バンドを選択した時と同じ面積を選択して Measure すればいいでしょう。スタンダードカーブを使って DNA の絶対量に変換するなら、バックグラウンドの差し引きは必ずしも必要ないですが。 なるほど．空のレーンを用意しておけばいいのですね． とりあえず，再度サンプルなどを調製し，早急に検討してみます． もう少し解決は先にしておきますので，その他の御意見，情報などあればどんどんお願いします．

(無題) 削除/引用 No.2636-4 - 2009/01/13 (火) 19:56:00 - T > このcalibrationとは，NIHよりダウンロードできるstep-tabletを用いて行う校正のことでしょうか? いや、そうではなく、要はデジタル画像の数値が DNA 量を正しく反映しているかどうかを評価するということです。例えば、まず PCR product と同じサイズで濃度が分かっているサンプルの希釈系列を作って泳動し、スタンダードカーブを描くという方法があります。数値が DNA 量と直線的に比例する領域は結構狭いはずです。それから PCR サンプルの希釈系列を泳動し、直線部分に乗る範囲を使ってデータにすれば、ある程度信頼できる数値が得られるでしょう。 > バックグラウンドを除去するにはどの様な手順で行えばいいのでしょうか?また，このバックグラウンドとはアガロースゲルの適当な部分の輝度ということでしょうか? そうなります。簡便には、サンプルを乗せていないレーンで、DNA バンドと同じような高さの位置から、バンドを選択した時と同じ面積を選択して Measure すればいいでしょう。スタンダードカーブを使って DNA の絶対量に変換するなら、バックグラウンドの差し引きは必ずしも必要ないですが。

(無題) 削除/引用 No.2636-3 - 2009/01/13 (火) 19:17:43 - 核酸初心者 Tさん 詳細な情報および御意見を頂きありがたく思います． >[Re:2] Tさんは書きました : > もちろん出てきた値はバックグラウンドも含んでいますし、saturate している場合もあるので、きちんとした calibration が必要です。 このcalibrationとは，NIHよりダウンロードできるstep-tabletを用いて行う校正のことでしょうか? あと，今一度御教授願いたいのが，バックグラウンドを除去するにはどの様な手順で行えばいいのでしょうか?また，このバックグラウンドとはアガロースゲルの適当な部分の輝度ということでしょうか? 追加質問で恐縮ですが，御教授いただけるとありがたいです． よろしくお願いします．

(無題) 削除/引用 No.2636-2 - 2009/01/13 (火) 16:01:44 - T Analyze → Measure とすれば、デフォルトでは Area 以外に Mean の値も得られるはずです。これは選択した範囲に含まれるシグナルの強さの平均値です。従って、Area × Mean を算出すれば、その部分に含まれるシグナルの総計が得られます。自分で計算するのが面倒なら、Analyze → Set Measurements で Integrated Density をチェックしてから Measure すれば総計の値も出てきます。 もちろん出てきた値はバックグラウンドも含んでいますし、saturate している場合もあるので、きちんとした calibration が必要です。

ImageJで輝度？を数値化 削除/引用 No.2636-1 - 2009/01/13 (火) 15:31:21 - 核酸初心者 PCR初心者で色々と理解不足があり，皆様の知恵をお借りできればと思います． 現在，肝組織より調製したtotal RNAより逆転写反応後，ラットβ-actinのPCRを行っています． ここで，サイクル数を20〜36サイクルまで2サイクル毎にPCR産物を回収し，アガロースゲルで電気泳動を行いました．このゲルをエチブロ染色および写真撮影後，ImageJでバンドを数値化しようと試みましたが，resultにareaの数値しか出ませんでした．これは面積であり輝度(brightness)ではないと思い，輝度を算出する方法を過去ログやネット上で調べましたが今ひとつ（全く？）理解できていません． バイオ実験イラストレイテッドなどを見ながら勉強中ですが，皆様のお知恵を拝借できれば輝度の数値化に関する情報や手順などを御教授いただければ幸いです． 言葉足らずな文章かもしれませんが，よろしくお願いします．

全10件 ( 1 〜 10 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---