全5件 ( 1 〜 5 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.2631-5 - 2009/01/13 (火) 11:08:11 - DSC オリゴの片側の末端は「ATC」で始まるように、反対側の末端は異なる配列で始まるようにしておけば、「ATC」側はEcoRVの切断部位と結合して再びEcoRVの認識部位（GATATC）になります。ベクター上でEcoRV部位から少し離れた位置を切断する制限酵素XとEcoRVの組合わせでdouble digestすれば、正向きに入ったものと逆向きに入ったものでは切り出される長さが30bp違うので、区別できると思います（EcoRVとXの切断部位間は100〜500bpくらいがよいでしょうね）。

(無題) 削除/引用 No.2631-4 - 2009/01/13 (火) 00:56:47 - q 30bpならQuikchangeでできるかも

(無題) 削除/引用 No.2631-3 - 2009/01/13 (火) 00:25:06 - j ------(EcoR5)------ ↓ ------【30bp oligo】--------------------- ↓ 　　------->　　　　　　　　　<------- な感じでPCRとか。

(無題) 削除/引用 No.2631-2 - 2009/01/13 (火) 00:24:57 - ザンギ ちょっと前にそっくりの質問があったと思いますが．．． インサートする部位から適当に離れた場所にインサートへ向けてPCRプライマーをひとつ作っておいて、挿入したDNAとPCRが組めるようにしておけばインサートの有無と向きがコロニーPCR等でチェックできます。 ちなみに．．． 平滑末端なのでベクターを脱リン酸化してインサートをリン酸化したくなりますが、修飾を通常と逆にしておいてライゲーション反応時のインサートを過剰量（100倍〜1000倍くらい）突っ込むと効率よくアタリがとれます。 なんにしろ配列の確認は必要ではありますけどね．．． こういうのって実験書に載ってないんですかね。

構築についてご教授ください。 削除/引用 No.2631-1 - 2009/01/12 (月) 22:10:11 - ぷーさん 現在、 遺伝子内のEcoR5サイト内に30bpほどのoligoを挿入しようと考えています。 以下のような感じです。 ------(EcoR5)------ ↓ ------【30bp oligo】------- 30bpのoligo内にはBamH1サイトがあるので、挿入の確認はBamH1で確認は可能です。ですがインサートの向きを確かめる為にシーケンス等を用いなければならない手間がかかります。一回だけならいいのですが、この先何度か行う予定なのです。そこでoligoは自由に設計はできますので、何か初めから方向を決めることができるいい方法はないでしょうか。簡便に挿入できる方法などはないでしょうか。ご教授下さい。

全5件 ( 1 〜 5 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

---