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(無題) 削除/引用 No.2624-8 - 2009/01/13 (火) 20:49:08 - ちゃん 皆様 様々なコメントありがとうございます。 AP様 とても貴重な文献ありがとうございます。 じっくりと理解してみたいと思います。 石川様 > 私は今約3kbのインサートをライゲーションしようとしているのですが、 > 長いインサートというのはどれくらいの長さのことをいうのでしょうか？ > 私が個人的に長いと感じるのは5kbp以上からが比較的ライゲーションができなくなることがあるので、5kbp以上が長いと感じます。 >[Re:4] 古老さんは書きました : > 私の理解は次のとおりです。DNAは柔軟な糸のようなものなので、一方の端から見た他方の端の"濃度"はDNAの長さが短いほど高くなります（短いほど両端の距離が近い）。ベクターとインサートがまず一端でライゲーションされた後に、他方の端がお互いにライゲーションされて（分子内ライゲーション）望む構造のライゲーション産物が得られる場合と、他の分子と無駄なライゲーション（分子間ライゲーション）が起こる場合のどちらがより起こりやすいかは、どちらの端の濃度が高いかに依存し、したがってDNAの長さに依存します。もちろん短いほど分子内ライゲーションが起こりやすく、長いほど分子間ライゲーションが起こりやすくなるわけです。 確かに、 長いともう片方の末端に出会う確率が低そうですね。

(無題) 削除/引用 No.2624-7 - 2009/01/13 (火) 19:00:12 - おお >[Re:5] 石川さんは書きました : > 他人のトピックに勝手に割り込んですいません。 > 回答ではないのですが、気になることがあるので質問させてください。 > > 私は今約3kbのインサートをライゲーションしようとしているのですが、 > 長いインサートというのはどれくらいの長さのことをいうのでしょうか？ > それは、多分主観でしょう。3kbは長いといえば長いですが、もっと長いものも 存在しますし。とぴ主さんはどれくらいでレシオを1:1にするのでしょうか?

(無題) 削除/引用 No.2624-6 - 2009/01/13 (火) 15:02:33 - AP まず、私自身はlibrary構築などの特殊な場合を除き、 日常的なsubcloningやrecloningなどではinsert/vector ratioは あまり気にしません。一応、モル比で1:1前後くらいが目安ですが、 数倍程度のズレは気にせず、ハンドリングしやすい分量を優先します。 そういった目的では、効率を気にしなくても目的の物は取れますから。 Molecular Cloningの最新版で、この点を重視しないようになったのも （1:1くらいにしろとだけ書いてある）、クリティカルな問題ではないからでしょう。 理論的な説明は、この辺が参考になると思います （2番目のは購読していないので未読ですが）。 http://www.invitrogen.com/etc/medialib/en/filelibrary/pdf/focus.Par.55414.File.tmp/Focus%20Volume%202%20Issue%202.PDF http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=pubmed&cmd=search&term=+An+equation+for+calculating+the+volumetric+ratios+required+in+a+ligation+reaction 当然予想できることですが、単にinsert/vector ratioだけでなく、 DNAの濃度の影響もあります。例えば、おなじvolume、同じvector量で insert量を振ってratioを変えると、DNAの濃度変化も起こるので、 ratioだけの影響とは言い切れません。 逆に言うと、異なるratioなら、それなりの最適なvolume、最適なDNA濃度の 選びようがあるのかもしれません。 また、環状化するのと直鎖化する（lambda vectorの場合のように）のでも、 一方を脱リン酸化した場合でも（脱リン酸したDNAは過剰にでき、そのほうが効率が良くなると予想される）違いますし。 トピ主さんでも他のかたでも、興味がありましたら上の文献を読んで、 簡単に解説していただけると、、、、

質問があります！ 削除/引用 No.2624-5 - 2009/01/13 (火) 12:11:11 - 石川 他人のトピックに勝手に割り込んですいません。 回答ではないのですが、気になることがあるので質問させてください。 私は今約3kbのインサートをライゲーションしようとしているのですが、 長いインサートというのはどれくらいの長さのことをいうのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2624-4 - 2009/01/13 (火) 11:29:09 - 古老 古い版のMolecular Cloningにはこの問題に関する理論的な考察が書いてあったのですが、新しい版では割愛されていますね。図書館などに古い版があるのではないかと思いますので、お読みになってはいかがでしょうか。第２版だと1.63からです。 私の理解は次のとおりです。DNAは柔軟な糸のようなものなので、一方の端から見た他方の端の"濃度"はDNAの長さが短いほど高くなります（短いほど両端の距離が近い）。ベクターとインサートがまず一端でライゲーションされた後に、他方の端がお互いにライゲーションされて（分子内ライゲーション）望む構造のライゲーション産物が得られる場合と、他の分子と無駄なライゲーション（分子間ライゲーション）が起こる場合のどちらがより起こりやすいかは、どちらの端の濃度が高いかに依存し、したがってDNAの長さに依存します。もちろん短いほど分子内ライゲーションが起こりやすく、長いほど分子間ライゲーションが起こりやすくなるわけです。

(無題) 削除/引用 No.2624-3 - 2009/01/12 (月) 17:09:23 - おお 長いと、タンデムにつながる可能性が大きくなるためではないでしょうか、、、

(無題) 削除/引用 No.2624-2 - 2009/01/12 (月) 16:41:04 - ｐ 経験的なもんなんじゃないですか？ 科学的根拠を推定することならできますけど。。 メーカーのﾌﾟﾛﾄｺﾙも経験的なもんだった気が。。。

ライゲーションのDNA比率 削除/引用 No.2624-1 - 2009/01/10 (土) 16:35:30 - ちゃん 一般的に ベクターとインサートDNAをライゲーションする場合にその比率は 1:3などが効率がよいです。 またインサートが短い場合は多く入れたほうが良かったり、 インサートが長い場合は1:1あたりが良かったりします。 そこで疑問に思うのは なぜ長いインサートの場合は多く入れると駄目なのでしょうか？ 経験的にそれでいいのは分っているのですが、後輩にうまく説明できません。 どなたか教えてください。 よろしくお願いします。

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