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(無題) 削除/引用 No.2623-4 - 2009/01/15 (木) 10:34:41 - やまさき マイクロサテライトということはゲノムをPCRしているわけですよね。内部がGCリッチだったりする場合、5%〜10％のDMSO入れたりすると改善する場合があります。また経験上タッチダウンが効果的だったりします。また酵素の種類によっても大きく結果は変わります。 私は初めて行うPCrの場合は温度条件を2種類、バッファー条件を2種類（DMSOなしとあり）の計4種類を試します。また酵素は宝のExTaqHSを使用しています。酵素は好みもあると思いますが、私は増やすだけならこの酵素が最強と思っています。フラグメント解析なら問題ないと思います。

(無題) 削除/引用 No.2623-3 - 2009/01/13 (火) 20:14:32 - おお PCRはマシーンによってもかかり具合が変わってきたりしますし、計算ででるTm値は 目安でしかありませんので、それ以下でもしっかりかかるプライマーはあります。 まあ、いちど下げて試してください。

(無題) 削除/引用 No.2623-2 - 2009/01/13 (火) 11:14:04 - jazzmessenger > 論文に書いてあるアニーリング温度は６０℃で、実際に計算したアニーリング温度はF…５７℃、R…５８℃より少し高めに設定してありました。 > > 少しアニーリング温度を下げてPCRをかけてみようと思うのですが、F-primerの蛍光色素に影響がないか心配です。 Tmはプログラムや計算方法によって変わるので、2-3度の違いはよくあることです。 蛍光色素への影響はないと思います。PCR産物だけできれば問題ありませんから。

Microsatellite marker・・蛍光色素とアニーリング温度について 削除/引用 No.2623-1 - 2009/01/10 (土) 16:02:53 - kobuhei 初歩的な質問をさせてもらいます。 マイクロサテライトマーカーを使用しているのですが、ひとつのprimerのみうまくいきません。 そのprimerのPCR時のアニーリング温度は、参考としている論文と同じ温度（使用しているprimerもその論文を参考に作りました）にしてぃます。 論文に書いてあるアニーリング温度は６０℃で、実際に計算したアニーリング温度はF…５７℃、R…５８℃より少し高めに設定してありました。 少しアニーリング温度を下げてPCRをかけてみようと思うのですが、F-primerの蛍光色素に影響がないか心配です。 また、今後のためにマイクロサテライトマーカーのトラブルシューティング的な例があれば教えてください。 よろしくお願いします。

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