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(無題) 削除/引用 No.2621-6 - 2009/01/13 (火) 22:13:25 - CJ なるほど。皆様参考になりました。ありがとうございます。蛋白は変性でよいのでPARISキットを買う必要はなさそうです。

(無題) 削除/引用 No.2621-5 - 2009/01/13 (火) 21:26:09 - おお 昔はTRIZOLで処理してから保存していました、得られた試料を そのまま凍結して必要時にRNAを取るのはRNAの安定性を 考えるとちょっと怖いと思っていましたから。そういう意味では RNAlaterは使った方がいいのではないかと思えますね。 だた、凍結切片とか必要な時はそこから削ってRNAをとるなど やれることはやれるので、実験しだいかと思います。 最近はRNAを取ったサンプルからタンパクを取りたいというのが あって(RNAよう、タンパク用にそれぞれ実験しなくてすむなど の理由で)RNA調せいの残りをタンパク用に回しています。 もちろん変性状態なので、SDSPAGE、WBぐらいにしか使えませんが。 私はGEのカラムのキットをつかってます。カラムの素通りのフラクション をアセトンで沈殿してます。QAGENのカラムのRNAせいせいキットには、 同様のタンパク回収プロトコールが載っていたと思います。 回収率がどうかということについてはあまり詳しく調べたわけでは ありませんが、ロスがあって困るということは今のところ ないです。 TRIZOLでやり方はほとんど同じとおもいます。 アセトンなどの沈殿は、ゲノムのDNAなど混じっていると 沈殿を溶解するのが難しくなります。そのへんが難点 かもしれません。

マニュアル参照 削除/引用 No.2621-4 - 2009/01/13 (火) 20:29:14 - TS Trizol、Tri-reagent系は、RNA, DNA, proteinを分離するために設計されています。 マニュアルを見れば、きちんと載っていますよ。 おっしゃるとおり、WBにはタンパク質が変性されてても問題ないので使えると言うことになります。 たしかに99%以上の人が、RNA抽出にしか使っていないと思いますけど。

(無題) 削除/引用 No.2621-3 - 2009/01/12 (月) 22:25:01 - CJ お返事ありがとうございます。 なるほど。RNAlaterには結構なアドバンテージがありそうですね。 ちょっと驚いたのはTrizolで蛋白が取り出せる、ということです。あれって強力な変性剤ですが、Westernとかで使う分には問題ないってことでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2621-2 - 2009/01/10 (土) 09:39:48 - ナンバー９ 1,についてなのですが、質は凍結保存の方法によって変わってきます。サンプルを取り出して素早く液体窒素にいれてー80℃保存した場合と素早くRNAlaterに入れた場合はそれほど違いがあったということは有りませんでした。しかし、時間をおいてしまってから液体窒素で凍らせたサンプルとでは違いがある（RNAが分解されている）印象です。RNAlaterの利点としては液体窒素で凍らせる必要なく液体中へ入れるだけでRNAを安定化させられるということではないでしょうか。 2,3についてですが、私はRNAlater→TRIZOLでRNA及びタンパク質を抽出していましたが両方とも問題なく抽出できました。Ambionのものは使用したことがありませんので比較はできませんが。

RNAlater 削除/引用 No.2621-1 - 2009/01/10 (土) 00:21:09 - CJ 私は時々なんちゃってモレキュラー実験をやる程度のスキルの持ち主です。今までトータルRNA抽出時には試料を凍結保存しておいて、それをTrizol処理してきました。これから得られたtotalRNAを元にRT-PCRなどを行ってin situ hybridization用のリボプローブなどを作ってこれたので、まずまずRNAは保存できていたのだと思います。ここからが本題で、Ambionの情報によれば、RNAlaterを使うとRNAの保存はとてもよい上、たんぱく質も（変性するものの）保存され、AmbionのPARIS kitなるものをつかえば1つのサンプルからRNAと蛋白の両方が回収できるのだそうです。今後ウエスタンなども行おうと思っておりまして、もしこれらの試薬が有用ならば試してみようかと思っております。ここをご覧になっている方で、RNAlaterやPARISキットを使われている方に質問です。 １：RNAlaterは従来法よりもRNAの収量や質がよかったですか？ ２：PARISキットや類似品はSDSで組織をつぶすのに比べて収量はよいのでしょうか？ ３：RNAlater処理組織から蛋白を回収したことがありますか？あった場合、収量は従来法と比べてどうだったでしょうか？ ものすごいど素人丸出しの質問で申し訳ないのですが、よろしくお願いします。

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