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血清中タンパクのウエスタンについて トピック削除
No.2613-TOPIC - 2009/01/08 (木) 16:29:23 - タンパク初心者
いつも勉強させて頂き，ありがとうございます。
タンパク実験初心者ですので，教えて頂けないでしょうか？
血清中のタンパク（およそ10kDaで血中濃度は1000ng/ml程度）をウエスタンで検出したいのですが，そのまま血清を泳動しても濃度が薄いため検出されないと思い，血清を濃縮しようと考えています。
その方法としてTCA沈殿を試みたのですが，沈殿物が多く最終の泳動バッファーでの溶解操作を少量のバッファーで行うことができません。
これに関し何か改善点やよい方法がないか，そもそもこの方法自体が適していないのか，忌憚なき御意見を賜りたいと思いますので，何卒よろしくお願い致します。
タンパクに関しては初心者ですので，愚問をお許し下さい。
　
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No.2613-7 - 2009/01/13 (火) 00:01:26 - こうじ
普通に反応する抗体なら1ul分をローディングして見えると思うのですが
10kDaで100ng/ml程度の一桁低いレベルで普通に検出していますよ

(無題) 削除/引用
No.2613-6 - 2009/01/09 (金) 01:10:49 - おお
手っ取り早くIP、ウエスタンとかでもいいかと思いますが。
回収率さへ一定してれば、

ELISAを使わない理由はなにかありますか?

それと低分子ということでいろいろサジェスチョン
がありますが、もしランニングゲルにTRIS-HCLpH8.8
をお使いになっているならばバッファーの濃度を2倍
にしてみてください。かなり分解能が改善されます。
私はいつもそのレシピでやってます。

なぜ検出できないのでしょうかね、、、
検出系とかほかに怪しいところがありませんでしょうか。

(無題) 削除/引用
No.2613-5 - 2009/01/08 (木) 21:53:47 - C
硫安カットでもいいし、ブルーセファロースでアルブミンをprotein GカラムでIgGを除去してから必要なら濃縮するのもオーソドックスなやり方とおもうけど、気をつけないといけないのはどんな分画法（分子量でカットする濃縮フィルターは便利だけど膜にくっついてなくなる場合があるから第一選択としてはあまり勧めない）でも特異的に決まったものだけを除くというわけではないから、この過程で自分の見たい物がいっしょにどっかいってしまったらそれは困るので、まずは前処理無しで何点か１倍〜１０倍くらいでラフにアプライ量を変えて、やってみてるのがいいとおもう。幸いにして10KDaということなので、AlbuminやIgGやTfからは場所的にはかなり離れててあまり邪魔されないだろうし低分子量領域の血清蛋白質は少ないから、載せすぎたときに上の方の泳動パタンがはげしく乱れることに目をつぶれば、検出は行けそうな気がする。15%くらいのゲルがいいとおもう。

(無題) 削除/引用
No.2613-4 - 2009/01/08 (木) 19:18:33 - AP
ふつうWestern blotでは、CBBや銀染色で見えないくらいのタンパク質でも検出できます。つまりngオーダー以下、数pg程度あれば十分なはずです。

1000ng/mlが書き間違いでなければ、1 uLも流せば鼻血がでるくらいたっぷり標的タンパク質が乗るはずですが。また、血清中の総タンパク質量を考えると、1レーンに乗せられるのは、そんな程度で、それ以上はあんまり増やせないと思います。もし濃縮を考えるなら、グロブリンやアルブミンなどメジャーなタンパク質（これだけで数十mg/mLくらいを占める）を除去する方向で考えた方がいいでしょう（古典的な硫安沈殿などでもいいですが、それようのカラムも市販されています）。

(無題) 削除/引用
No.2613-3 - 2009/01/08 (木) 18:45:08 - りょう
1マイクログラム/1mlは高濃度じゃないですか？
抗体の質にもよるでしょうが5マイクロリットルくらい泳動すればECLで検出できないでしょうか？泳動もそんなに乱れないと思います。

(無題) 削除/引用
No.2613-2 - 2009/01/08 (木) 17:00:28 - EcoRI
血清は高濃度タンパク質なので、TCAによる沈殿物が多いのは当然の結果です。

まずは分画が必要かと思います。
硫安沈殿などで粗分画して、(スモールスケールデ)
SDS-PAGE->WBを行った方がいいかもしれません。
目的のタンパク質が回収される硫安濃度が判明したら、その硫安沈殿物をゲル濾過して、
TCA沈殿を行って、SDS-PAGE->WBを行うと、奇麗なバンドがでると考えられます。

硫安沈殿の段階で奇麗なバンドが観察されるかもしれませんが、まぁ、やってみないとわからないですね。

それから、目的タンパク質が10 kDaと小さいので、
普通のSDS-PAGEでは、きちんと分離されないかもしれません。
Tricine SDS-PAGEやBis-Tris/MES SDS-PAGEを検討する必要があるでしょう。

血清中タンパクのウエスタンについて 削除/引用
No.2613-1 - 2009/01/08 (木) 16:29:23 - タンパク初心者
いつも勉強させて頂き，ありがとうございます。
タンパク実験初心者ですので，教えて頂けないでしょうか？
血清中のタンパク（およそ10kDaで血中濃度は1000ng/ml程度）をウエスタンで検出したいのですが，そのまま血清を泳動しても濃度が薄いため検出されないと思い，血清を濃縮しようと考えています。
その方法としてTCA沈殿を試みたのですが，沈殿物が多く最終の泳動バッファーでの溶解操作を少量のバッファーで行うことができません。
これに関し何か改善点やよい方法がないか，そもそもこの方法自体が適していないのか，忌憚なき御意見を賜りたいと思いますので，何卒よろしくお願い致します。
タンパクに関しては初心者ですので，愚問をお許し下さい。
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