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(無題) 削除/引用 No.2610-7 - 2009/01/10 (土) 19:26:41 - EcoRI PEGだと、もしかすると、不溶化するかもしれません。（硫安はどうかな） 血清をPEGで分画すると、確実に不溶化したタンパク質ができます。 (血清という高濃度タンパク質溶液だからかもしれませんが) セントリコンなど、遠心式の濃縮キットが利用できるなら、そっちをお薦めします。 まぁ、いずれの方法にしてもロスは避けられないところが、 タンパクの濃縮で頭が痛いところなんですが

(無題) 削除/引用 No.2610-6 - 2009/01/10 (土) 18:15:48 - 人事労務 >溶出Bufferがグリシン-HCl（pH2.5）なので、中和？するため、トリス-HCl(pH８)の平衡化Bufferで透析すると聞いた気がするのですが、今回の目的の場合でしたら、最初からPBSで透析してしまえばいいでしょうか？！ それとも、平衡化Bufferで透析後、PBSで透析すれば良いのでしょうか？ EcoR1さんのおっしゃられているように、pH2.5でエリューション後、すぐにTris-HClで中和すべきだと思います。透析だとはるかに中和に時間がかかります。 ですので、EcoR1さんのようにいつも僕はチューブにTris-HClを入れておいてpH2.5のeluateがそこに落下するようにカラムを立てます。 その後、一晩ＰＢＳに対して透析を行います。

(無題) 削除/引用 No.2610-5 - 2009/01/10 (土) 17:17:38 - EcoRI >はい。毎回、PBSで溶解して抗原をひいてますが、問題なく行えています。 なるほど かなり手軽になりますね >溶出Bufferがグリシン-HCl（pH2.5）なので、中和？するため、トリス-HCl(pH８)の平衡化Bufferで透析すると聞いた気がするのですが、 納得しました でしたら、溶出物を受けるチューブにあらかじめ、Tris-HClを入れておいて、 溶出即中和、という状態にしておけばいいのですよ。 そうすれば、タンパクにダメージを与える時間が少なくなります。 また、透析よりも遥かに短時間で済みます。 まぁ、中和(pH7~7.5)するのに、溶出液 1 mlあたりに、Trisがどれくらい必要か、 という予備実験はすべきですが。 中和したサンプルはHPLCとか透析とかでPBSに置換すればいいはずです。 >PEG沈殿はDNAレベルでの話と思ったのですが、一般的なタンパク濃縮方法 一般的かどうかはわかりませんが、私はよくやります。 「PEG タンパク質 沈殿」で検索してみてください。

(無題) 削除/引用 No.2610-4 - 2009/01/10 (土) 16:44:28 - ゆず いろいろとアドバイスいただき、ありがとうございます。 > というか、最近のプレートはPBSでもいけるのですか？ はい。毎回、PBSで溶解して抗原をひいてますが、問題なく行えています。 > ところで、精製したものを平衡化Bufferに対して透析するのは何を意図しているのでしょうか？ > 単純に、精製標品をPBSなりCarbonate Bufferで透析して、濃縮するわけにはいかないのでしょうか？ 溶出Bufferがグリシン-HCl（pH2.5）なので、中和？するため、トリス-HCl(pH８)の平衡化Bufferで透析すると聞いた気がするのですが、今回の目的の場合でしたら、最初からPBSで透析してしまえばいいでしょうか？！ それとも、平衡化Bufferで透析後、PBSで透析すれば良いのでしょうか？ PEG沈殿はDNAレベルでの話と思ったのですが、一般的なタンパク濃縮方法なでしょうか？見当違いな質問でしたら、申し訳ありません。まだまだ未知分野なもので・・。

(無題) 削除/引用 No.2610-3 - 2009/01/08 (木) 10:55:52 - EcoRI アセトン沈殿だと、タンパクが変性する恐れがあるので、あまり適切ではないと思います 硫安とかPEGで沈殿させて、少量のPBSとかCarbonate Bufferに溶解させるのがいいかと思います。 というか、最近のプレートはPBSでもいけるのですか？ Carbonate BufferでpHを高くしてやらないと、プレートに吸着しない と教わった記憶があるので、Carbonate Bufferに置換していました。 セントリコンなどの分画分子量ですが、本当に目安です。 きちんと畳み込まれたタンパク質のサイズは、アミノ酸配列から推定される値よりも小さいことが多いです。 タンパク質ごとに用いる膜と最適な遠心スピードを検討しなければなりません。 15 kDa のタンパクを10 kDaのMWCOの膜で濃縮して、PAGEで濃縮具合をみたら、 多くが下部にいってしまった、なんてこともあります。 ところで、精製したものを平衡化Bufferに対して透析するのは何を意図しているのでしょうか？ 単純に、精製標品をPBSなりCarbonate Bufferで透析して、濃縮するわけにはいかないのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.2610-2 - 2009/01/07 (水) 23:20:03 - うんこ >まず、カラム精製にて溶出したものを平衡化Bufferで透析し、それを濃縮したいと思うのですが、セントリコンなどの限外ろ過チューブでの分画分子量の目安がよく分かりません。 平衡化Bufferで透析し終えたら、今度はPBSで透析すれば…？あるいはpHを上げるか。carbonate bufferとかで。 濃縮は…アセトン沈殿とかではだめかな？

ELISAの抗原を作製中 削除/引用 No.2610-1 - 2009/01/07 (水) 22:34:27 - ゆず ELISAの抗原として利用したいタンパクを、動物細胞で発現させ、現在、カラム精製の段階まできています。そこで、最終精製品に関してどう進めていけばいいのか分からないでおります。 まず、カラム精製にて溶出したものを平衡化Bufferで透析し、それを濃縮したいと思うのですが、セントリコンなどの限外ろ過チューブでの分画分子量の目安がよく分かりません。 また、ELISA時の抗原の溶媒に関してですが、これまでは凍結乾燥品を購入して、PBSで溶解していたのですが、今回、自ら精製した物の溶媒は平衡化Bufferになっています。ELISAの抗原の溶媒は、どうするのがベストなのでしょうか。 アドバイスいただけると嬉しいです。 宜しくお願い致します。

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