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ごめんなさい 削除/引用 No.2609-9 - 2009/01/07 (水) 22:14:58 - プラスミドDNA 質問者です。 皆さん、回答ありがとうございます。 皆さんを混乱させてしまったみたいですね。ごめんなさい。 質問の意図としては、精製操作によってEtBrが抜けるのかどうかでした。 以前からこのような方法が用いられているのは当然知っていましたが、 本当に大丈夫かと思い質問しました。

(無題) 削除/引用 No.2609-7 - 2009/01/07 (水) 20:11:16 - ~ あれ？ ベクターを細胞に導入するときにリニアに切って、 ごみの部分を除くために泳動して回収しているのだと思っていましたが、 サブクローニングするんですね。 昔は、塩化セシウム平衡密度勾配遠心法でEtBrまみれだったDNAを精製してトランスフェクションに使っていました。 その操作法を見れば、どの程度トランスフェクションに影響するEtBrが残るのかは分かると思います。

(無題) 削除/引用 No.2609-6 - 2009/01/07 (水) 18:20:16 - おお >[Re:5] 一兵卒さんは書きました : > あまりにぶっ飛んだご質問なので、皆さんのご回答も、的確なお答えの後に別の話が続いていたり、やや混乱気味のようですね。 > そうなんですよね、、質問の意図は何処にあるのでしょうか、、、 というのが実感なんですが、、、、 質問者さま、いかがなもんでしょうか、、、

(無題) 削除/引用 No.2609-5 - 2009/01/07 (水) 18:05:46 - 一兵卒 あまりにぶっ飛んだご質問なので、皆さんのご回答も、的確なお答えの後に別の話が続いていたり、やや混乱気味のようですね。 プラスミドの構築で使用したEtBrは、出来上がったプラスミドを大腸菌で増やしたものには持ち込まれません。したがってトランスフェクションには何の影響もありません。

(無題) 削除/引用 No.2609-4 - 2009/01/07 (水) 17:12:27 - AP トランスフェクションに対するEtBrの影響の心配をしていて、そのEtBrはプラスミドをコンストラクトする段階で、DNA断片の切り出しをするときに加えたもののことでしょうか。 アガロースからDNAを抽出するほとんどの方法で、EtBrは除去されます。アガロース片からfreeze-thawや遠心で直接回収するような場合は残留するかもしれませんが、コンストラクトして大腸菌等で増やした段階でEtBrがはまっているDNA分子がのこるわけはないですね。 さらに、トランスフェクションに使うプラスミドの調製は、古典的には、また現在でももっとも上等の精製ができる方法として、CsCl密度勾配超遠心が使われてきました。このときに加えるEtBrの量はゲルを染める場合より２，３桁濃くて、肉眼でもDNAが赤く見えるほどです。それでも、ブタノール抽出やエタノール沈殿くらいの操作で除去できてトランスフェクションに支障はありません。

(無題) 削除/引用 No.2609-3 - 2009/01/07 (水) 16:59:18 - おお どうもしっくりこないのですが、ゲルから切り出して、、、 ベクターに組み込むのになぜ、細胞に導入する時の ことを気にしているのでしょうか、、、 実際エチブロがDNAに結合した状態で沈殿したとすれば ペレットが赤くなるようにおもいますが、実際そうでも ないですし、260nmの吸収を測る時かし光などの吸収 など出てくるはずですが、そんな変なことはおこったり していません。アルコールでほぼ抜けているだろうな と思っています。 そもそも、EtBrが悪さするのに、昔からずっとこの方法で やられているというのはあまりおこりれないと思いません でしょうか、、、 EtBrが大量にある時はブタノールで抽出したり、 イオン交換樹脂で除いたりすることがあります。 これはもれクロにものっていますので調べてみれば とおもいます。 そのほか、ミュータジェンとしてはたらくのは、P450で活性か された状態ということですので、そのままの状態では そういう活性がほとんどないようです。 もしそれでも気になるようでしたら、メチレンブルー を使ってゲルを染色されたらいいかと思います。 これももれクロにのっていますし、同等の染色 キットもうっていると思います。

(無題) 削除/引用 No.2609-2 - 2009/01/07 (水) 16:30:31 - ~ ゲルからの切り出し後にどのような操作をされているのか分かりませんが、 エタ沈などで除けます。 昔から行われている超遠心でもEtBrは使われていますし、 気になるのでしたら精製後に、endotoxin freeカラムなどのメーカーがtransfection用に出しているカラムを通してはいかがでしょうか。

EtBrの影響 削除/引用 No.2609-1 - 2009/01/07 (水) 15:57:28 - プラスミドDNA プラスミドDNAを作製するときに、目的遺伝子をPCR後にゲルから切り出し、それをベクターに組込もうと考えています。 しかし、この際にEtBrの影響がいかほどかについての疑問が出てきました。 シークエンスの確認程度なら問題ないと思うのですが、培養細胞にトランスフェクションしたいので、どのようにしたらいいか迷っています。 EtBr染色後にゲルから切り出したものを使用しても影響がないものなのか？それとも、ゲルから切り出す方法以外で行なうべきなのか？ もしご存知の方がいらっしゃれば教えてくださると幸いです。

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