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(無題) 削除/引用 No.2605-7 - 2009/01/10 (土) 15:38:02 - キナーゼ No 2605-6の書き込みはこのトピへの返信ではありません。 間違え書き込み失礼しました。

ベクターの違い 削除/引用 No.2605-6 - 2009/01/10 (土) 15:27:49 - キナーゼ いつも勉強させていただいています。 現在あるキナーゼの発現ベクターを作成しているのですが、２つの異なる発現ベクターに同じキナーゼを組み込んで、細胞にトランスフェクションすると、ベクターによって逆の表現型が見られました。 ベクターAでは細胞増殖が亢進し、ベクターBでは細胞増殖が遅くなりました（死んではいません）。3種類の細胞株で同じ現象が見られています。 それぞれのベクターにGFP入れたものや空ベクターをトランスフェクションしたものでは増殖に変化はありませんでした。 ウエスタンで発現チェックしたところ発現量はベクターによって殆ど変わりませんでした。 訳が分からなかったのですがとりあえずさらに別の２つの発現ベクターに組み込んでみたら、また片方では細胞増殖が速くなり、もう片方では遅くなりました。 プラスミドを精製しなおしても結果は変わりませんでした。 知りたいのはこのキナーゼによって細胞増殖がどう変化するかということです。このキナーゼはsiRNAで叩くと増殖が遅くなるため、増殖促進する機能があると予測しているのですが、過剰発現の実験で相反する複数のデータが出て解釈に困っています。 ベクターの違いによって結果が変わる場合、どのような解決策が考えられるのかアドバイスいただければ幸いです。

(無題) 削除/引用 No.2605-5 - 2009/01/10 (土) 12:22:15 - クローン おお様、名無し様 コメントありがとうございました。 基本的にはケースバイケースで、ストーリーの中でその実験の占めるウェートが大きくなればなるほどコントロールの選択がシビアになる、と自分の中で理解しました。 コントロールが真に適切かどうかという問題は突き詰めれば突き詰めるほどしんどくなりそうで、別のアプローチで補強データを集めていった方が精神衛生上にもいいような気がします。 とりあえずは、シングルクローンを取得してみることに致します。

(無題) 削除/引用 No.2605-4 - 2009/01/07 (水) 17:09:29 - おお >[Re:3] 名無しさんは書きました : > とくに問題なければ単にホストの細胞株をコントロールとしている人もいると思います。 多分いるでしょうね。でも私がれビューアーまかされたら、そのあたりは、 きっちり指摘します。要するに論文を通す段階になって困ることがないか というのがひとつあります。 それと、実験で何を見るのかという点でも結論が変わってきます。いろいろな ほかの実験根拠などがあるばあいは、そこに重きをおかないでいい と思えることもあります。 ちょっと冷静に実験全体をみわたした方がいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.2605-3 - 2009/01/07 (水) 13:11:27 - 名無し すごい昔にステーブルとったときは、コントロールとして、空ベクター（タグペプチド部分のみ含む）を発現させてシングルクローンをクローニングしました。タグがかなり大きいのでWBで発現チェックもできました。指導教員に指示されたわけではなくて、たまたま暇だったのと、単にやっぱそのほうがいいかなと思ってそうしました。クローニングはじめたあとで先生に聞いたらそうだねそのほうがいいかもね、といっていたので、特に決まりがあるわけではないとおもいます。とくに問題なければ単にホストの細胞株をコントロールとしている人もいると思います。

(無題) 削除/引用 No.2605-2 - 2009/01/07 (水) 05:57:27 - おお これは実際難しい話で、結果をある程度意図的にいじれる ようなところがあると思います。 シングルクローンを取るような場合は、コントロールも シングルで取った方がいいと思います。 というのはクローナルバリエーションが生じますので、 そのバリエーションの範囲ないの差を見ているか、 バリエーション以上の差があるのかをはっきりさせて おく必要があるからです。 2については選択はランダムにするしかないと言うのが 実感です。

細胞のクローニングの際にコントロール細胞はどうすべき？ 削除/引用 No.2605-1 - 2009/01/07 (水) 05:16:53 - クローン 平素より勉強させていただいております。 外来遺伝子を細胞に導入し安定発現細胞を得る際、細胞のクローニングに持っていく場合が多々あるかと思いますが、その際に対象となるコントロール細胞（空ベクター発現細胞など）もクローニング操作を行うのが一般的なのでしょうか？ １．クローニング過程（特にコロニーを育てる間に）で細胞が分化してキャラクターが少し変わってしまうという可能性を考えるとクローニング操作を同様にするべき ２．親細胞が多少なりともヘテロな集団の場合、コントロール細胞でもクローン間のキャラクターによる違いを考慮して適切な株を決定しなければならなくなり、この判断が難しい この2つを考え、自分の中で判断が下せません。 門外漢でスタンダードを知らず、周りに細胞実験に詳しい方がいないため、皆様のご意見を伺いたく思います。皆様がどのようになされているか教えていただけると幸いです。よろしくお願いいたします。

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