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気になりますね 削除/引用 No.2603-9 - 2009/01/07 (水) 21:06:29 - DDD 調製後のmediumを滅菌させるより mediumに加える試薬をフィルター滅菌してからmediumに加える のがベターだと思いますが。。。 mediumのstockに不溶性の物質が生じるのでしょうか？ それとも、細胞を培養しているとそこに生じるのか？

(無題) 削除/引用 No.2603-8 - 2009/01/07 (水) 10:13:42 - おお マイコプラズマのコンタミの特徴的症状を書いておきます。 バイチが3-4日すると、突然黄色場合によっては薄い緑に 変化し出す。 そのころには細胞が死にますが、けいだい後細胞増殖は 抑制されることと、促進(異常増殖)されることがあります。 染色体などの不安定かが見られることがありますが、 培養レベルではわからないでしょう。 もちろんけいだい後じょじょに細胞の調子が悪くなってきます。 検出方法で簡便なのは、 培養後3日めぐらいにメタノールで固定して、DAPIなどで染めれば、 核外、細胞外にドット状や雲がかかったように蛍光が観察されます。 PCRのほうが感度がいいかもしれませんが、細胞が調子悪くなる くらいなら、これでも検出できることがたいていです。 というわけで、マイコプラズマよりバクテリアっぽいなと ちょっと思うわけです。

(無題) 削除/引用 No.2603-7 - 2009/01/07 (水) 10:06:24 - 名無しさん 数週間後に培地がはげしくピンクになっているということなので、細胞はほとんど死んでしまっているのではないでしょうか。不溶物の正体よりもその方がすごく気になります。骨芽細胞の特性を知らないのであくまで一般的な細胞培養の知識からですが、実験につかう細胞としてはあまり好ましい状態ではない様に思います。あと骨の細胞ということからふと思ったのですが、あとカルシウムやリン酸などとなにかの成分がくっついて難溶性の塩が生じたという可能性は考えられるでしょうか。 10-20%血清含有培地でもフィルター滅菌は出来ます。ただシリンジでやる小さい丸いフィルターだと量が多いときはだんだん詰まってきて手が疲れるしどうしても何回かフィルターをとり変えることになるので、リザーバーと培地容器が一体になってるポンプで引きながらやるディスポのやつを使ったほうが表面積も広いし楽だと思います。フィルターは0.22くらいのものを使ってください。滅菌目的ならば0.45は×です。 お話では不溶物は培養後に生じてくる無生物らしいので、はじめにフィルター通すことが有効かどうかは？です。肉眼でみえて顕微鏡でみえないというのも？で、塩とかそういうものなのかなともおもいます。

(無題) 削除/引用 No.2603-6 - 2009/01/07 (水) 09:24:29 - ~ 不溶性のものと濁りというのは同じものを指しているのでしょうか？ また、それらは両方とも培養しないで冷蔵保存している培地でも生じるのでしょうか？ 不溶性のものは血清の澱かも知れません。 マイコプラズマで培地が濁るまでになった話は聞いたことがありません。 そのためコンタミを疑うのであれば、まずはその濁った培地をフレッシュな(抗生物質無添加のRPMI)培地に少量添加して、増えるかどうかを見ておいた方がいいかと思います。 マイコプラズマであることを疑っているのであれば、他のラボにある細胞を分けてもらって、それに少量添加してみてはいかがでしょうか。 細胞のストックが駄目になっていたり、 以前の実験と血清のロットが変わっていたり、 添加剤の濃度を間違えていたりしませんか？ 培養して初めて濁りが生じるのであれば、 細胞の具合が悪くなったために死細胞から濁りや不溶性のものが生じているのかもしれません。 フィルターを通すのであれば、20%ウシ血清を含むとフィルター滅菌は難しいかもしれません。 ウシ血清だけをプレフィルター(ろ紙)を通して0.2umのフィルター滅菌して、フィルター滅菌済みの培地に添加したほうがいいかもしれません。 ボトルトップフィルターを水平ではなく傾けて持って端から注いでいくと、 水平のものにいきなり全量入れるよりも詰まり難いような気がします。 また、ウイルス除去フィルターは販売されていますが、製造向けのスケールしか見たことがありません。 使っている試薬を全部買いなおした方が安く上がると思います。

(無題) 削除/引用 No.2603-5 - 2009/01/06 (火) 19:59:04 - おお すでに指摘がありますように、マイコプラズマはフィルターではむりです。 マイコプラズマを考えているなら、培養用のものを買い直すとか でしょうか、、、有機溶媒系に溶けているのならさほど問題ない かもしれません。 あと、フィルターを通すにしても血清入りって0.2umは厳しくないかなあ とちょっと思います。血清抜きで溶かしてフィルターしてから 血清加えるほうが楽かもしれません。ん、そうすると吸着 の問題も出てくるか、、、、、物を直接フィルターする方が 濃度を考えるといいかもしれません。 臭いにおいはしませんか?もしそうならバクテリアです。 ま、バクテリアなら、通常の培養で使う顕微鏡で 形は見えるほど大きくないにしろ、いるのは確認できますが、、、、 均一な何かドット状のものが無数にあるような感じです。 濁っているということなのでバクテリアっぽくもおもえます。 あとは加える濃度間違えてるとか、、、、、 この辺はよく分かりません。

(無題) 削除/引用 No.2603-4 - 2009/01/06 (火) 19:49:27 - hime osteoblastの培養や分化にRANKLを加えるのですか？ それはおいといて、フィルター滅菌（0.22um)でよいと思います。 また、RANKL等を加えた培地は小分けして凍結保存した方が好ましいです。 実際、市販されているosteoclastやosteoblastの分化誘導（維持）培地等は長期間使用する場合は小分けにせよとか書いてあるものがありますので。

(無題) 削除/引用 No.2603-3 - 2009/01/06 (火) 19:48:08 - 培養初心者 EcoRIさん アドバイスありがとうございます。 medium調整後、だいだい色をしていますが、不溶性の物が浮く時には激しくピンクです… pHの問題か…

(無題) 削除/引用 No.2603-2 - 2009/01/06 (火) 18:52:28 - EcoRI マイコプラズマは0.2umのフィルターでは除けませんが… コンタミの原因がマイコプラズマである、ということではないようですので、 まずは、0.2umのフィルターを通すのが一番手っ取り早いでしょう。 あとは、medium調整後にUVをあてるとか でも、UVで分解がおきそう… >mediumが濁ったり不溶性のものが見られるようになるってのは何なのでしょうか？ 培地のpHがどちらかに偏って、培地、というかFBS中のタンパクが変性したのではないでしょうか？ またpHの偏りで細胞が死んで、それが不溶性の物質になっているのかも…

血清入り培養液に薬剤等を加えた後に非加熱で滅菌したい場合 削除/引用 No.2603-1 - 2009/01/06 (火) 18:35:31 - 培養初心者 お世話になります。 みな様のアドバイスをいただけないでしょうか？ 現在、骨芽細胞培養のためPTHやRANKL等の因子を加え、培養を開始したいと考えております。 しかし、どうもPTHあるいはRANKLに何かがコンタミしているのか、mediumに不溶性のものがmedium調整後数週間後に見られるようになります。 しかし、細胞のいるフラスコを顕微鏡で観察しても、眼に見える酵母等のコンタミは見られません。 マイコプラズマとか眼に見えないものかもしれません。 細胞の調子はますます悪くなります。（以前と比べると） そこで、調製後のmediumを滅菌したいのですが、filter滅菌が一般的だとは思いますが、0.2 um（マイクロメーター）の径で行えばいいでしょうか？ あるいは、みなさんならどこを疑いますか？ 顕微鏡で眼に見えるコンタミは見られないのに、mediumが濁ったり不溶性のものが見られるようになるってのは何なのでしょうか？ タンパクなどが変成したりするのでしょうか？ mediumとは、RPMI1640に20 % FBS、5 U/ml ヘパリン、PTH、RANKLなどです。 疑わしいところはありますでしょうか？どうかお知恵をお貸しいただけないでしょうか？ よろしくお願いいたします。

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