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(無題) 削除/引用 No.2602-12 - 2009/01/12 (月) 22:30:39 - CJ ははあ、かなり特殊な方法をお使いなのですね。その固定法と自家蛍光の関係についてはちょっと私の知識の範囲外です。お役に立てずすみません。

(無題) 削除/引用 No.2602-11 - 2009/01/10 (土) 13:21:46 - ブラッド 今回の実験ではSDラット雄10週齢の下大静脈、大腿動静脈、上腕動静脈などを採取して、すぐに酢酸エタノールに浸漬し一晩固定しPBSでリンス、cryoprotection後に凍結切片を作成しました。スライドグラスはマツナミのシランコートのもの、カバースリップは処理なし。封入剤はSLOWFADEを用いました。しかし、SLOWFADEを使わないでPBSで封入しても結果は変わりませんでした（血管中膜を中心に、弾性板のパターンの強い自家蛍光が出現します）。

(無題) 削除/引用 No.2602-10 - 2009/01/10 (土) 00:07:25 - CJ もし差し支えなければ、固定法や、カバースリップ時の封入剤について教えていただけますか？

(無題) 削除/引用 No.2602-9 - 2009/01/09 (金) 19:48:37 - ブラッド 参考になります。次は固定液を変えて実験してみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.2602-8 - 2009/01/08 (木) 06:50:38 - CJ 参考になるかわかりませんが、昔ホルムアルデヒド蛍光法（試料を凍結乾燥した後フォルマリン蒸気で処理することによってアミンが蛍光物質に変化するので、これをパラフィン抱埋して切削してキシレンで封入して観察する方法）をやっていたときにおっしゃるものとまったく同等の自家蛍光が常に観察されました。ただ、私個人は通常の脳切片で問題を感じたことはありません。11週令は決して老齢とはいえませんので、何か技法に問題があるのかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2602-7 - 2009/01/07 (水) 22:17:29 - ブラッド どうも有り難うございます。ラットは業者から購入してすぐにサンプルを作ったもので、特に変わったものではないです（SDの雄です）。「血管の自家蛍光」をキーワードにネットを検索すると英語のページがヒットして、そこに血管のコラーゲンと特にエラスチンが強い自家蛍光を持つということが書いてありました。今回の蛍光顕微鏡による私の観察所見も、組織学のテキストにある弾性板の組織化学染色のものにそっくりなので「ああ、なるほどエラスチンなのだな」と考えた次第です。具体的に自分で証明はしておりません。

(無題) 削除/引用 No.2602-6 - 2009/01/07 (水) 09:24:00 - 名無しさん 11-12週齢ならまだとても若いので加齢に伴う変化ではないようにおもいます。ただ糖尿病や動脈硬化などの病態モデル動物ならば若くても血管の蛋白質に先に書いたような変化が出てくるかもしれないとも思います。あと自家蛍光のもとがコラーゲン等でなくてエラスチンということはどのようにして判明したのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2602-5 - 2009/01/07 (水) 09:02:44 - ブラッド コメント有り難うございます。ラットは11-12週齢です。より若いものも検討したいと思います。リポフスチンの自家蛍光はマウスを使用しているときに脳切片で経験しました（40週齢）。リポフスチン蛍光は細胞内にドット状に出現して、ブルーレーザーとグリーンレーザーのいずれでも励起されましたが、グリーンレーザーによる赤色蛍光の輝度がより強く、今回のラット血管の自家蛍光（弾性繊維の組織化学染色に見られるような連続した波状の蛍光）はブルーレーザーによる緑色蛍光の輝度が強いです（グリーンレーザーでも励起されています）。また、当方の設備では、633や647領域の蛍光可視化に対応してないので、化学処理でなんとか出来ないかと唸っていた次第です。JHC論文の御指示を有り難うございます。

(無題) 削除/引用 No.2602-4 - 2009/01/06 (火) 23:52:45 - CJ 強力に自家蛍光を始末する方法が報告されています。 染色後切片を固定し、 1 mM CuSO4 in 50 mM ammonium acetate, pH5 で1時間処理します。 くわしくは J Histochem Cytochem 1999 Jun;47(6):719-30 を参照してください。老齢動物を使用する場合、この手の方法は必須であると考えています。

(無題) 削除/引用 No.2602-3 - 2009/01/06 (火) 18:21:18 - とおりすが〜り ほんとうにエラスチンですか？老齢のネズミの血管だとリポフスチンではないかなと思うのですが。ともかく、こういうのは消すのが難しいので、記録するときに自家蛍光とかぶらないような蛍光基を持つ２次抗体を使う方が簡単な気がします。Alexa633や647などの赤外のが大抵使える場合が多いです。

(無題) 削除/引用 No.2602-2 - 2009/01/06 (火) 17:22:46 - 名無しさん エラスチンの自家蛍光のオリジンとなる構造はよくわかりませんが、架橋形成、非酵素的糖化やアミノ酸側鎖の酸化などの蛋白質修飾等に起因するものでしょうか。そうだとしたら、実験に月齢があまり関係ないならば、より若い健康な動物を使ってみたらどうでしょうか。

ラット血管のエラスチンの自家蛍光を抑える方法 削除/引用 No.2602-1 - 2009/01/06 (火) 15:52:01 - ブラッド ラット血管の凍結切片をスライドグラスに貼付け蛍光顕微鏡で観察すると非常に強い自家蛍光が中膜を中心に認められ、エラスチンによるものだと知りました。インターネットで紹介されているテクニカルチップを頼りに塩化アンモニウム、トルイジンブルーを前処置してみましたが、この自家蛍光は一向に褪色しません。よい褪色方法を御存知でしたらよろしく御指導ください。お願いします。

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