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RIPA中のSDSの影響は？ 削除/引用 No.260-11 - 2007/10/01 (月) 13:25:41 - ats (1)RIPA中にSDSが0.1％含まれていますので、タンパク−タンパク結合の解離・抗体の変性（結合しなくなる）などに注意が必要です。 EGFRでしたら特別なことがない限り、SDSを含まない（TritonX-100,NP-40に置き換える等）処方が良いと思います。 MAPK（だったと思います）は、0.1％SDS含有RIPAで細胞を溶解し、10倍に希釈して(0.01% SDS)からIPしてくださいと教わったことがあります。0.1％SDSは、細胞骨格に（弱く？）結合しているタンパクも可溶化するようです。 (2)また、リン酸化EGFRを検出するなら、phosphatase Inhibor（およびprotease inhibitor）を加えた方が再現性がよくなります。 細胞刺激時にproteasome inhibitorを培地に添加しておくことも効果があることがあります。 (3)培養細胞ではなく、組織から抽出する場合は、抽出液量にも注意が必要です。 界面活性剤が不足すると可溶化が不十分になり、再現性が乏しくなります。

(無題) 削除/引用 No.260-10 - 2007/09/30 (日) 20:18:11 - BY TS さん ありがとうございます。TSさんが言われるとように膜画分を用いてWBしてみようと思います。MAPK/ERK系のリン酸化を見たかったので同じくcell signalingのY1064 P-EGFRの抗体を用いましたが、やはりシグナルが弱かったせいか、バンドが出ませんでした。もう一度、膜画分でその抗体でやってみてもし無理だったらTSさんのおっしゃるY1173で試してみようかと思います(教授の許可が出たらですけどね)。ポジコンも何とか用意したいところです。いろいろとありがとうございます。

ポジコン 削除/引用 No.260-9 - 2007/09/30 (日) 17:28:13 - TS 付け加え忘れましたが、可能であれば、positive controlが欲しいところですね。Basalのリン酸化は非常に少ないと思いますので、たとえばEGFで刺激したときの脳を取ってみるとか。確実にリン酸化されてるサンプルが。

(無題) 削除/引用 No.260-8 - 2007/09/30 (日) 17:25:02 - TS 使用したのは、Cell signaling technologyの、Y1173のリン酸化を検出するラビットポリクロです。No. 4407 http://www.cellsignal.com/products/4407.html 私の場合、EGFで培養細胞を刺激したときの検出でしたので、非常に簡単に検出できました。知人も同じ抗体を使っていましたが、良い抗体、というイメージです。 細胞膜画分についてですが、必要な画分を濃縮するのは手だと思いますけど。BYさんのばあい、BasalのEGFRリン酸化を検出したいと言うことですので、簡単ではないとは思います。しかし、わたしの感覚的なものですが、細胞膜画分は、全細胞画分のうちの１−２％ではないでしょうか？EGFRは、膜にしかないわけですから、単純計算でも数十倍から１００倍程度感度が上昇すると考えて良いと思います。 IPして定量性を下げるよりも、わたしなら分画をトライしたいと思うところです。

(無題) 削除/引用 No.260-7 - 2007/09/30 (日) 15:51:39 - BY TSさんへ 貴重なアドバイスありがとうございます。以前リン酸化EGFR抗体やりましたが、バンドが出なくて免沈することにしました。TSさんが以前うまくいったP-EGFRの抗体について詳しく教えていただけませんか？また、細胞膜画分を調製すると弱いシグナルでもバンドが出ることはありますか？なにしろ特に刺激を与えていないマウスの脳組織での検討なのでリン酸化シグナルは弱いことが予想されます。

(無題) 削除/引用 No.260-6 - 2007/09/30 (日) 11:22:16 - TS 目的ですが、EGFRのリン酸化をみたいと言うことでよろしいのでしょうか？ EGFRの発現量にもよるかもしれませんが、リン酸化EGFR抗体を使うのがだめですか？私は、以前にやりましたが、total cell lysateでも検出できましたし、発現量が少なければ、細胞膜画分を調製するというのもありだとおもいますが。 IPも以前やりましたが、Takaraのモノクロを使いました。NativeのEGFRしか認識しないということでしたので、native条件で抽出して、IPして、PLCg1, EGFRをIBして問題なくできましたよ。 何か手助けになれば。

(無題) 削除/引用 No.260-5 - 2007/09/30 (日) 11:07:52 - Ｔ EGFR のバンドが見えるなら免沈はうまく行っているということでは？ 素直に解釈すれば、活性化されていないのでリン酸化されていないという事でしょう。 EGF の調製法や投与法を見直してみてはどうでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.260-4 - 2007/09/30 (日) 10:50:37 - BY 大変申し訳ありません。詳しく説明させていただきます。 1)protein G-agaroseはpreclear時、IP時にどのくらい使用していますか。 1チューブあたり20μl使用しています。data sheet に従っています。ただこれは研究室にあったもので、GやAやセファロースの使い分けはいまいち分からないのでご存知でしたら御教授頂きたいです。 2)EGFP抗体はIPに使用できるグレードですか。 私の記述がややこしくてすいません。IPはEGF受容体(EGFR)の抗体で行なっています。EGFR抗体はIPの用途があったため使用してます。ただ、IP後のEGFRでのWBはレーン全体が発色してそこに少しだけEGFRのバンドが見える状態です。 3)RIPAバッファーの組成は？細胞はきちんと溶解されていますか。 150 mM NaCl, 1.0% IGEPAL® CA-630, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 50 mM Tris, pH 8.0. 塩濃度が重要と聞いていたので150 mM ということで使用しています。ヒストコロンでホモジナイズしているため細胞は溶解していると思います。 一度、抗体を変えてトライしてるのですが、以前も同様の結果でした。抗体が悪いのかプロトコールが悪いのか分からない状態です。何かアドバイスをいただけると幸いです。

(無題) 削除/引用 No.260-3 - 2007/09/30 (日) 09:26:32 - まめせん 間違え、分かりにくいところがあったので、再度、投稿します。 EGFP抗体でIPしたものはEGFP抗体で検出できますか？ 詳しい実験系が分からないので、良く分かりません。 1)protein G-agaroseはpreclear時、IP時にどのくらい使用していますか。 2)EGFP抗体はIPに使用できるグレードですか。 3)RIPAバッファーの組成は？細胞はきちんと溶解されていますか。 詳しく書いていただけると、他の方もあなたの力になってくれやすいと思いますよ。

(無題) 削除/引用 No.260-2 - 2007/09/30 (日) 09:19:16 - まめせん EGFPの抗体で検出できますか？ 詳しい実験系が分からないなので、良く分かりません。 1)protein G-agaroseはどのくらい使用していますか。 2)EGFP抗体はIPに使用できるグレードするか。 3)RIPAバッファーの組成は？細胞はきちんと溶解されていますか。 詳しく書いていただけると、他の方もあなたの力になってくれると思います。

免疫沈降がうまくいきません 削除/引用 No.260-1 - 2007/09/29 (土) 17:03:40 - BY 現在EGFR抗体を用いて免疫沈降を行なっているのですが上手くいきません。 組織サンプルをRIPA bufferを用いてサンタクルーズのProtein G PLUS-AgaroseとEGFR抗体で免沈をして、チロシンリン酸化抗体でwesternしているのですがバンドが検出されません。分子量の大きなタンパクは免沈が難しいとも聞いたことがあります。いろいろ原因を考えているのですが、詳しい原因が分かりません。 �@Protein G PLUS-Agaroseをセファロース等の他のビーズに代えたほうがいいのでしょうか？ �A抗体の特異性が悪いのでしょうか？ �BBufferが悪いのでしょうか？ 免疫沈降に詳しい方がいましたら教えてください。

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