初めまして。いつも勉強させて頂いてます。
今回はお力を貸して頂きたくトピックを作成致しました。
Upstate社のChIPキットを用いてクロマチン免疫沈降実験を行っています。
最近になっておよそ200〜1000bpの断片化DNAになるソニケーション条件を確立でき、免疫沈降→IP DNAの精製→PCR→電気泳動という操作を現在はしていますが、壁にぶつかって困っています。
壁とは、GAPDHプライマーを用いたPCRでネガティブコントロールでもポジティブコントロールと同じ程度のバンドが出てしまうことです。input DNAが混入してしまっているのが原因だと考え、
@ビーズの洗浄の際、細い注射針を付けたシリンジをアスピレーターに
つなぎで上清を吸引除去するようにして遠心後の上清をなるべく完全に 取り除く。
AエッペンにDNAが吸着する可能性もあるので、最後の洗浄の際に新しい
エッペンに変える。
以上の2点を変えて実験をしてみましたが、ほとんど結果は変わりませんでした。ネガティブコントロールのバンドを消すアドバイスがありましたらよろしくお願い致します。
また、続きで長くなって申し訳ありませんが、もう一つ質問があります。
免疫沈降してきたDNAをPCRで検出する前に、自分が目的としているタンパク質が今使っている抗体で免疫沈降されているのかを調べたいと思っています。
そこで、免疫沈降後、ビーズからクロスリンクタンパク質/DNAを抽出し、クロスリンクを除去したサンプルをイムノブロットしようと考えているのですが、その方法で大丈夫でしょうか？
文章が拙く、申し訳ありませんが、どうぞよろしくお願いします。 |
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