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(無題) 削除/引用 No.26-22 - 2007/09/03 (月) 23:14:09 - ミント >[Re:21] まめせんさん > ウエスタンで確認すると書かれていたので、例えば、ヒストンH3のアセチル化を見たいとすれば、ヒストンH3のバンドでそろえるというようなことです。しかし、その場合はヒストンH3でもIPしなければなりません。 > お返事ありがとうございます。 イムノブロットに挑戦してみたいと思います。 GAPDHプライマーを用いたPCRでポジコンとネガコンのシグナルが同程度で困っているということを書きましたが、免疫沈降したDNAを希釈して再度PCRを行ったところ、40サイクルでポジコンは0.1%input程度、ネガコンではバンドが見られなくなりました。 一つ問題はクリアーできたのですが、まだバックグランドが高めであると思われるので、磁気ビーズを使ってみたいと今は考えています。 まだまだ問題は山積みであると思いますので皆様今後もよろしくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.26-21 - 2007/09/01 (土) 09:35:20 - まめせん ウエスタンで確認すると書かれていたので、例えば、ヒストンH3のアセチル化を見たいとすれば、ヒストンH3のバンドでそろえるというようなことです。しかし、その場合はヒストンH3でもIPしなければなりません。

(無題) 削除/引用 No.26-20 - 2007/08/30 (木) 10:04:27 - ミント >[Re:19] まめせんさん ありがとうございます。返事が遅くなってしまい申し訳ありません。 やはりタンパク質量は測れないのですね。 > タンパク質量を測るのは無理だと思います。 > ポジコンのバンドをそろえて、サンプル毎に量を変えて、目的のタンパク質を検出されれば良いと思います。 一つ質問なのですが、ここでおっしゃっているポジコンとは何を指していらっしゃるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.26-19 - 2007/08/27 (月) 16:00:37 - まめせん タンパク質量を測るのは無理だと思います。 ポジコンのバンドをそろえて、サンプル毎に量を変えて、目的のタンパク質を検出されれば良いと思います。

(無題) 削除/引用 No.26-18 - 2007/08/24 (金) 18:19:49 - ミント >今回、洗浄の方法を変えて回収したDNAをPCRしてみました。 洗浄方法は以下の通りです。 　Low salt Buffer 1回 > 　High salt Buffer 1回 > 　LiCl Buffer 1回 > 　TE Buffer 4回 > > それぞれ1mlのbufferを加えた後、5分間、4℃でrotationしながらインキュベート。その後、遠心をしてビーズを沈殿させ、注射針を用いて上清を吸引除去。最後のTE bufferを加える時に新しいエッペンに変える。 >前回との違いは・・・ TE bufferの回数を2→4回に増やしました。 > また、最後の吸引除去の時だけ、アスピレーターを用いた吸引除去ではなく、チップを用いて上清を完全に吸い取るようにしてみました。 > >その結果、GAPDHプライマー(キットに含まれていたコントロールプライマー)を用いたPCRにおいて、ネガティブコントロールは0.01%　input程度のバンドになりました。 しかし、Anti-acetyl-histone H3を用いたポジティブコントロールも0.01%程度のバンドしか得られませんでした。 > > キットに入っていた説明書にのっていた図とは明らかに違う結果です。 Anti-acetyl-histone H3で免疫沈降されていないのではないかと考えられますが、プロトコールどおりのクロマチン量及び抗体量、手順で行っているので何がダメなのかがまったく分らず困っています。 似たような経験がある方はいらっしゃいませんか？ > > >

(無題) 削除/引用 No.26-17 - 2007/08/23 (木) 15:23:37 - ミント UpstateのChIPプロトコールにある方法で、目的のタンパク質がちゃんと抗体によって免疫沈降されているかどうかを確認しようと考えています。 その際、一つ質問があるのですが、タンパク質濃度は測定できないのでしょうか？ beads/antibody/protein/Chromatin Complexの状態ではproteinだけの量を測定することはできないですよね？ bufferを加えてboilして変性してしまった後でも無理のような気もしますし。 プロトコールにはゲルにアプライする容量なども記載されているので濃度測定は必要ないのかもしれませんが、どれだけのタンパク質が沈降されたのかをできたら知りたいと考えています。 質問ばかりで申し訳ありませんが、ご存知の方どうぞお願いします。

(無題) 削除/引用 No.26-16 - 2007/08/22 (水) 09:38:17 - ミント tipさん> > > 磁気ビーズに変えると、バックグラウンドは0.01% input以下になりました > また、最終的なwash条件は、LiCl Buffer 20sec×5回 + TE Buffer 20sec×1回に落ち着きました。 磁気ビーズを用いた場合は、LiCl Bufferのwashは20sec×3回でもバックはほとんど落ちていました。非常にお勧めです。 > 磁気ビーズはバックグラウンドを減らすのに非常に有効のようですね！貴重なお話ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.26-15 - 2007/08/11 (土) 12:44:15 - tip ちなみに… 私も始めはwash回数を増やしました。具体的には… Low salt Buffer 2回 High salt Buffer 2回 LiCl Buffer 2回 TE Buffer 4回 といった具合です。しかし、バックグラウンドは0.1% input程度にしか抑えられませんでした。 最終的には、目的のシグナルは0.1% input程度しか出ませんでしたので、この時は微妙な差としか捉えられず、とても自信がもてませんでした。 磁気ビーズに変えると、バックグラウンドは0.01% input以下になりましたので、目的のシグナルは容易に検出出来た次第です。 また、最終的なwash条件は、LiCl Buffer 20sec×5回 + TE Buffer 20sec×1回に落ち着きました。 磁気ビーズを用いた場合は、LiCl Bufferのwashは20sec×3回でもバックはほとんど落ちていました。非常にお勧めです。 参考になれば幸いです。

(無題) 削除/引用 No.26-14 - 2007/08/10 (金) 21:23:22 - ミント >[Re:12] tipさんは書きました : > inputと比較して、ネガコン抗体で免疫沈降した時のシグナルはどの程度でしょうか？ 0.5% input程度のシグナルが出てしまいました。 > 0.01%以上のシグナルであれば、wash不足が最も疑われます。 私もwash不足が一番の原因と考え、wash回数を増やして今回実験をしてみました。まだ、サンプルを回収するところまでしかしていないのですが。 > 私も、以前同様の現象に悩まされ、その時は1% input程のシグナルがネガコンでも出ていました。そこで、Dynabeadsという磁気ビーズを用いてwash効率を上げたところ、ネガコンのシグナルは0.01%以下に抑えられ、目的のシグナルも難なく得ることが出来ました。 磁気ビーズはやっぱりいいのですね！washでまったく改善が見られない時には検討してみたいと思います。ありがとうございます。 >[Re:13] まめせんさんは書きました : > どのような条件でされているのか教えていただけると幸いです。 初めはキットのプロトコール通りに行いました。 　Low salt Buffer 1回 　High salt Buffer 1回 　LiCl Buffer 1回 　TE Buffer 2回 それぞれ1mlのbufferを加えた後、5分間、4℃でrotationしながらインキュベート。その後、遠心をしてビーズを沈殿させ、注射針を用いて上清を吸引除去。 今回はTE bufferの回数を4回に増やしました。 また、最後の吸引除去の時だけ、アスピレーターを用いた吸引除去ではなく、チップを用いて上清を完全に吸い取るようにしてみました。 明日から休みに入るので、休みが明けたら今回、回収したサンプルをPCRしてみます。結果が出ましたら報告させて頂きます。よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.26-13 - 2007/08/08 (水) 17:30:15 - まめせん IPの時間と洗いの時間はどうでしょうか。 tipさんもいわれている通り、洗いは重要です。時間を長くしたり、回数を増やしてみることで改善するかもしれません。どのような条件でされているのか教えていただけると幸いです。

(無題) 削除/引用 No.26-12 - 2007/08/08 (水) 13:17:30 - tip inputと比較して、ネガコン抗体で免疫沈降した時のシグナルはどの程度でしょうか？ 0.01%以上のシグナルであれば、wash不足が最も疑われます。 私も、以前同様の現象に悩まされ、その時は1% input程のシグナルがネガコンでも出ていました。そこで、Dynabeadsという磁気ビーズを用いてwash効率を上げたところ、ネガコンのシグナルは0.01%以下に抑えられ、目的のシグナルも難なく得ることが出来ました。

(無題) 削除/引用 No.26-11 - 2007/08/08 (水) 12:03:20 - ミント >[Re:10] まめせんさん ポジコンの抗体でポジコン領域を増幅した場合はどうなっているのでしょうか。うまく行っているのでしょうか。 ポジコン抗体：anti-acetyl-histone H3 ポジコン領域：GAPDH　 ネガコン抗体：normal rabbit IgG （すべてキットに付属のもの） ポジコン抗体で免疫沈降したDNA templateでポジコン領域を増幅した場合には単一のバンドが得られています。 しかし、ネガコン抗体で免疫沈降したDNA templateでも同様の増幅が見られてしまうことが問題になっております。 Gapdhのプロモーター領域を特異的に増幅できることを確認したとありますが、シークエンスを行なっているのでしょうか。 シークエンスは行っておりませんが、目的のサイズの単一バンドが得られているので確認できたと考えています。

(無題) 削除/引用 No.26-10 - 2007/08/07 (火) 17:11:38 - まめせん > ChIPにも使用できると書かれているのですがそれでも難しいでしょうか？ ChIPにも使用できるのでしたら、抗体量を振ってみるしかありませんね。 どんな抗体を使って、どの領域を増幅しているのか分かりませんが、ポジコンの抗体でポジコン領域を増幅した場合はどうなっているのでしょうか。うまく行っているのでしょうか。 >キットには目的タンパク質を確認するプロトコールがのっていないのですが、どの時点のサンプルをウェスタンすればいいのでしょうか？ ご存じでしたら教えてください。お願いします。 私は以前にそのキットを使ったことがあるので、分かっています。 通りすがりさんも指摘されているように、プロトコールに書いてあります。 > input DNAにおいてはGAPDHプライマーでも自作のプライマーでも特異的に増幅できていることを確認しています。 しつこいようですが、Gapdhのプロモーター領域を特異的に増幅できることを確認したとありますが、シークエンスを行なっているのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.26-9 - 2007/08/06 (月) 16:57:59 - ミント >[Re:8] 通りすがりさんへ > キットに入っていたプロトコールしか見ておらず、このようなプロトコールがあることに気付きませんでした。 今後はもっと慎重に調べるように気をつけます。 なるべく早くこのプロトコールに沿って、イムノブロットをしてみたいと思います。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.26-8 - 2007/08/06 (月) 13:54:36 - 通りすがり >キットには目的タンパク質を確認するプロトコールがのっていないのですが、 いや、はっきりと書かれています。 ↓ http://www.upstate.com/misc/protocol_detail.q.prot.e.chrom_ip.a.name.e.Chromatin_Immunoprecipitation_Assay Section I. Immunoprecipitation/Immunoblot protocol to detect histone. 1. Following washing of the beads in part B, step 7, immunoprecipitated histones can be analyzed by immunoblot analysis. Add 25μl of 1X Laemmli buffer per sample and boil for 10 minutes. Load 20μl per lane and perform immunoblot procedure as described per appropriate antibody.

(無題) 削除/引用 No.26-7 - 2007/08/06 (月) 11:57:47 - ミント >[Re:6] まめせんさん > 私はIP用の抗体でChIPアッセイをしたことがありますが、ゲルシフト用の抗体では難しいのではないかと思います。 ChIPにも使用できると書かれているのですがそれでも難しいでしょうか？ > westernで目的タンパク質が確認できるかどうか試すのが良いと思います。 > Upstate社のキットを使用されているということなので、そのキットに添付されているプロトコールにそって行なわれるのが良いと思います。 キットには目的タンパク質を確認するプロトコールがのっていないのですが、どの時点のサンプルをウェスタンすればいいのでしょうか？ ご存じでしたら教えてください。お願いします。 > > PCRに関してですが、その部位だけを特異的に増幅できているのでしょうか。 input DNAにおいてはGAPDHプライマーでも自作のプライマーでも特異的に増幅できていることを確認しています。

(無題) 削除/引用 No.26-6 - 2007/08/06 (月) 07:59:49 - まめせん 私はIP用の抗体でChIPアッセイをしたことがありますが、ゲルシフト用の抗体では難しいのではないかと思います。ポジコンの抗体ではどうですか。 westernで目的タンパク質が確認できるかどうか試すのが良いと思います。 Upstate社のキットを使用されているということなので、そのキットに添付されているプロトコールにそって行なわれるのが良いと思います。 PCRに関してですが、その部位だけを特異的に増幅できているのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.26-5 - 2007/08/05 (日) 20:28:14 - ミント >[Re:4] PCRさん > サイクルを振ってポジネガを比較して差がでる条件を検討されたのでしょうか。 30,35,40と三点でサイクル数を振ってみましたが、ポジコンとネガコンの両方とも35サイクルで増え始めてしまいました。もう一度30,32,34で細かくサイクル数を振って実験してみようとは考えていますが、大きな差が出るとは思えないと考えています。 >[Re:3] まめせんさん > まず、IPに使っている抗体を教えて下さい。 書き忘れてしまって申し訳ありません。使っている抗体はrabbit IgGで、キットにネガティブコントロール用として入っていた抗体です。 >[Re:2] chipさん > 現在使用されてる抗体はChIPでの実績は既にあるんでしょうか？ ChIPで用いたという論文は残念ながら確認できていません。自分の研究室でゲルシフトアッセイで用いている抗体で、とりあえずやってみようと考え使用しています。 > あと、イムノブロットってproteinA/Gとかはどうするんですか？ ビーズは外さないとイムノブロットは無理かなと考えています。 なので、ビーズからクロスリンクタンパク質/DNA複合体を抽出し、その後クロスリンクを過熱によって除去したサンプルをイムノブロットすればいいかなと考えたのですが、どうでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.26-4 - 2007/08/03 (金) 23:14:46 - PCR PCRが飽和している可能性はどうでしょうか？サイクルを振ってポジネガを比較して差がでる条件を検討されたのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.26-3 - 2007/08/03 (金) 16:18:05 - まめせん まず、IPに使っている抗体を教えて下さい。 H3のK9K14アセチル化認識抗体でIPしているのであれば、当然、どちらも検出されるのではないでしょうか。GAPDHはどんな細胞でも出ていると思います。

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