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丁寧なご回答ありがとうございます 削除/引用 No.2599-13 - 2009/01/06 (火) 15:49:39 - 初心者 皆様 丁寧なご回答本当にありがとうございます。 論旨についての確認とのことですが、 お聞きしたかったことは、当初 既知の抗原に対する抗体の存在を知る方法ということでした。 存在の有無だけ知りたいなら、PAGE−WBでもよいとのことですよね。 その後、派生といたしまして、抗体があることがわかったのち、 Humanの抗体の論文で目にするELISAでのODでの比較は 1枚のプレートのみで可能なのか（というのも、Standardが確立してないと思うので）、 それとも、複数枚の比較が可能なのかということが疑問でした。 たとえば、 リウマチやCrohn病での自己抗体などの論文等で、 自己抗体の存在がわかったのち、 病勢に応じた力価の違いや、時系列での検体の評価などを行う場合、 検体を集めた後、一枚のプレートで一気にやっているのか、 複数プレートで行うならどういう計算で補正をかけているのか ということでしょうか。 ご指摘していただきましたように、 positive controlを見つけて、毎プレートにつかって、 補正をかけた表記（AU）であれば可能であり、 そのためには、陽性患者血清がたくさん必要ということなのですね。 ODで表記している論文等も見られますが、 その場合、補正として、 Interassayをしているのではないかと思っているのですが、 それがよくわからないところです。

(無題) 削除/引用 No.2599-10 - 2009/01/06 (火) 13:05:13 - EcoRI すいません、論点を確認させてください。 なんだか自分だけ的外れなレスをしている気がします。 トピ主様の問題点は以下の２点と理解しています。ここからして間違っていたら、私のレスは無視してください。 1)スタンダードのないELISAで、プレート間のサンプル中の自己抗体の有無を比較したい 2)ポシコンとして他種動物の抗原/抗体を用いたい 1)については、 スタンダードがない状態では、プレート間／サンプル間で抗体の「量」を測定するの無理だと考えます。 同一プレート内ならば、ODを比較することで、相対的な比較(2Bのサンプルには5Hのサンプルよりも多くの反応性抗体が含まれている)ということは可能かと存じます。 2)については、 あまりお薦めしない、というか、スマートではないように思います。 ヒト抗原にはヒト抗体を用いるのが、生理的な現象をmimicしている、と考えるからです

(無題) 削除/引用 No.2599-9 - 2009/01/06 (火) 12:32:35 - DC マウスへ抗原を免疫した際の血中抗体価測定でよく用いられるのは（PC抗体がない場合ですが）、段階希釈した血清のエンドポイントを抗体価として用いる方法があります。NCなどのコントロールとエンドポイント決定の際に用いるカットオフ値の設定さえしっかりしていればプレート間・サンプル間の比較が可能だと思います。 患者血清間での自己抗体の有無及び量の比較であれば、抗体価で評価できると思うのですがいかかでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2599-8 - 2009/01/06 (火) 05:18:23 - 免疫屋 OD比較はたまに拝見しますね． ご指摘のとおり同一プレート上での比較にしか用いる事ができないと思います． ヒトモノクロについて． EBVを用いて自己抗体産生クローンを不死化しモノクロを取る方法は確立されていたと思うので，そのようにして取ったモノクロを利用して自己抗体価を定量する場合もあったかと思います．臨床検査の現場はよく知りませんが，既にキット化されているものは恐らくこのようにして作成されたモノクロを利用しているのではないでしょうか？ モノクロを取って系の確立が一番確実かと思いますが，抗体強陽性患者由来の血清（場合によっては複数の患者由来の血清をプール）したものを利用しarbitrary unit表記にて測定値の大小を論じているものもありますね．まだ臨床検査の現場に導入されていない自己抗体の測定には陽性血清を用いる場合が主ではないでしょうか． ---- さて，問われている複数プレート間の比較方法についてですが，こういう状況ではやはり（プールしてでも）なるべく多くの陽性患者血清を確保することが肝要と思います． 次善の策として考えられるのは，ヒトIgGの希釈系列を置いてその値を参考にすることくらいでしょうか（適切かどうかはわかりませんけどね）． 抗原なしでIgGのみの固層化で良いのか，他の抗原を固層化したうえでそれに対するヒトIgGモノクロを利用するのが良いのかわかりませんが．． --- WBを利用する話もありますが，WBでも結局メンブレン間（でいいのか？）の比較には同じ問題が生じると思います． また，WBとELISAは併行して進めるべきものでどちらかに依存すべきではないような気もします．自己抗体が必ず変成タンパクを認識するかどうかわかりませんし，感度や定量性，多数検体の扱い等において不利な点もあるかと思います．一方，ELISAの場合には特異性の点で疑念も残るので，WBや他の方法での特異性の確認もしたいところです（もしその自己抗体の特徴が未知ならば）． また，目的が「新規の自己抗体の検出」にあるか「既知の自己抗体の定量」にあるかでも用いる方法が変わりますので，その辺も勘案したうえで方法を選んでいく必要があると思います． 長くなりましたがどこかが参考になれば．．．

(無題) 削除/引用 No.2599-7 - 2009/01/06 (火) 01:27:02 - おお >[Re:6] 初心者さんは書きました : > Ｈｕｍａｎの場合、 > > 抗原特異的ＩｇＧが市販されていないかと思っておりました。 > > Ｈｕｍａｎの抗体のＥＬＩＳＡでの解析の論文等で、 > > ＯＤで比較しているものを散見しますが、 > > これは、一枚のプレートでしか有効ではない解析なのでしょうか。 > そういえば、臨床で抗体価とか測る時、どうしているんでしょうね、、、 どなたか知っている人のレスが欲しいところですね。 基本的にはやれる範囲のことしかできませんから、プレート 間で共通のサンプルがオーバーラップするようにするとか が一番現実的なのかもしれません。

ありがとうございます。 削除/引用 No.2599-6 - 2009/01/05 (月) 23:00:49 - 初心者 再度ご回答ありがとうございます。 ＨｕｍａｎはＨｕｍａｎで行うのがスマートということですね。 既知の抗原にたいする抗体の存在は、 ＰＡＧＥ→ＷＢで確認し、次のステップということでしょうか。 ところで、無知で申し訳ないのですが、 後学のためにお聞きできたらうれしいのですが Ｈｕｍａｎの場合、 抗原特異的ＩｇＧが市販されていないかと思っておりました。 Ｈｕｍａｎの抗体のＥＬＩＳＡでの解析の論文等で、 ＯＤで比較しているものを散見しますが、 これは、一枚のプレートでしか有効ではない解析なのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.2599-5 - 2009/01/05 (月) 20:08:37 - EcoRI 抗ヒト抗原ヒト抗体を検出したい場合は、 二次抗体以外はヒト由来のものを使わないといけないと思います。 抗原のidentityがラットとヒトで相当高く、ラット抗体がヒト抗原に反応する、 というのならば、別の話ですが、すっきりとしたものではないと思います。 >sampleとstandardの比ということになりますか？ standardって、標準曲線のことですよね？ どの点を基準にてsampleとの比をとるのか？どうしてその点をとるのか？ その比が表すものは？ なんてことを考えるなら、 PAGE->WBの方がスマートな気がします。

(無題) 削除/引用 No.2599-4 - 2009/01/05 (月) 18:58:56 - 初心者 早い回答ありがとうございます。 異種動物(rat)の市販抗体(IgG)はあり、ratではELISAはできるようです。 Standard、ポジコンとして異種動物(rat)を使った場合、 当然、2次抗体は、anti-ratで、sampleはanti-humanですよね。 比較していく場合、 単位として、濃度やODではなくて、 sampleとstandardの比ということになりますか？ ELISAがまずとっかかりやすいかと思っておりましたので、 すみません、PAGEについては、もうすこし勉強してみます。

(無題) 削除/引用 No.2599-3 - 2009/01/05 (月) 18:33:00 - にた 似たようなことをやってたことがあります。 最終的にどこを目指すかで変わってくると思いますが、 その抗原に対する市販の抗体とかはないですか？ もちろん異種動物で。 市販抗体で希釈系列作って、その抗体の力価と比較して、 sampleの力価の強弱を判断してました。 有無を調べたいだけならEcoRIさんが書いたようにPAGEでやったほうが ややこしくなくていいと思います。 市販抗体を使ってELISAがワークしてるのは確認済みなんですよね？

(無題) 削除/引用 No.2599-2 - 2009/01/05 (月) 17:48:51 - EcoRI 抗原の希釈系列で作ったStandardがない時点で、 ELISAとしては成立しないように思いますが… 既知の自己抗原に対する抗体(未知)の有無だけなら、 SDS-PAGEで展開、転写して、転写した膜を短冊状にきりわけて、 サンプルに浸して、抗ヒト抗体で検出してもよくないですか？

Standardがない場合のELISAでの比較はどうしたらよいでしょうか 削除/引用 No.2599-1 - 2009/01/05 (月) 17:36:07 - 初心者 お世話になります。 実験初心者です。周りに詳しい方がいないので 教えていただきたいと思います。 Humanの自己抗原にたいする自己抗体の有無を知りたいとおもっております。 Standardがないので プレート間での比較をどのようにして行うべきでしょうか。 論文などでは、Interassay of coefficient of variationなるものを 書いてたりするのですが、それがどういうものなのかがいまいち理解できていないのです。 また、検体数が少なくポジコンとして1検体を使用し続けるには限界があるのですが、異種動物を使うのは、やってもよいことでしょうか？ 初心者で申し訳ありませんが、 ご教授いただけたら幸いです。

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