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(無題) 削除/引用 No.2596-15 - 2009/01/15 (木) 13:22:10 - じゃぱん MKさん、南国人ポーさん 色々と教えてくださってありがとうございます。とても助かります。 やはりノックアウトの作成は一筋縄ではいかないようですね。皆さんからの情報を参考にして、またもっとよくノックアウトの手法について勉強して実際に行うか考えてみようかと思います。どうもありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.2596-14 - 2009/01/10 (土) 23:47:45 - 南国人ポー HCT116は触ったことがありませんが、別の培養細胞株でジーンターゲティングを経験しています。 MKさんのコメントの内容とほぼ同意見です。 HCT116は相同組換え効率が高いという話を良く聞きますが、個人的には、組換え効率の値を見る限りでは（概ね1/1000以上）、他の培養細胞株と比べて数倍高い程度という印象を持っています。それでもスクリーニングの労力を考えれば非常に大きな違いですが。 培養体細胞株のノックアウトの成否は、標的遺伝子（相同組換えが起こり易い領域か否か、複数コピーか）とスクリーニングストラテジー（相同組換え体をいかに効率よく選抜・診断するか）の二つにかかっています。 後者に関しては、ベクターコンストラクトの設計と選抜方法の工夫でかなりカバーすることができます。 しかし、前者に関しては運頼みです。核型が近２倍体に維持されていても、実際には標的遺伝子が３コピー以上存在することもあれば、標的遺伝子のトポロジーやベクターとの相性の関係で、何千個何万個スクリーニングしても一つも取れないこともあります。 このリスクを勘案しても、ノックアウトを取得するメリットの方が大きければ、検討される価値はあると思います。特に、痕跡量の発現が生物機能に影響する標的遺伝子の場合にはノックダウンでは結果の解釈が難しく、機能の完全失活をもたらすノックアウトが有利です。 実際に行う場合は、可能であれば、HCT116のジーンターゲティングの実績のあるラボに細胞株の分譲を依頼することをお薦めします。 同じ細胞株でも所変われば別のサブラインですので。 案外、トライしてみたら、標的遺伝子が１コピーだけだった、なんてラッキーなこともあるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.2596-12 - 2009/01/10 (土) 20:10:41 - MK 私自身はやったことはないのですがやられている先生のお話を聞いたことはあります。 HCT116等は確かに他の細胞株に比べて組み換えを起こしやすい細胞株ですがES細胞と比べるとやはりその頻度は低いとのことでした。２つのアレルを潰さなくてはいけないのも考えると結構大変に感じました。 また癌細胞はゲノムが不安定化しているため、あまり継代回数が多くなってくると2Nよりも倍数化してしまいノックアウトするのが困難になるため、なるべく新しい状態のものを使ったほうがよいとも聞きました。

(無題) 削除/引用 No.2596-11 - 2009/01/09 (金) 22:20:24 - じゃぱん 南国人ポーさん 参考文献の紹介ありがとうございます。〜さんの紹介していただいた論文が掲載されている号ですね。参考にさせていただきます。 やはり細胞株でノックアウトを作成するのはそんなに難しいのでしょうか？この手の実験系にはあまり詳しくないもので…。ノックアウトできたらいいなあと思っていて、たまたま組み替えの効率がいい細胞ということを知ったので、一度やってみようかなと思いまして。

HCT116ではありませんが 削除/引用 No.2596-10 - 2009/01/08 (木) 23:37:49 - 南国人ポー Methods in Molecular Biology, vol.435 http://www.springerlink.com/content/r15844/?p=815c0f5b7c7947aeb07134a132b7c5f4&pi=0 あたりが参考になるかもしれません。 あとは・・・培養体細胞ということで・・・とにかく頑張って下さいとしか言いようがないです。 HCT116は、確かにDNA損傷修復タンパクのKOがいくつか樹立されている実績があるので、多少は効率がマシなのかな・・・?

(無題) 削除/引用 No.2596-4 - 2009/01/05 (月) 16:09:31 - じゃぱん 細胞の名前ですが、ヒト大腸癌細胞株のHCT116という細胞です。 細胞によって作成方法は異なるものなのでしょうか？どの細胞でも共通かと思いまして具体名は特にあげませんでした。すいません。 〜さん、参考文献の紹介ありがとうございます。少し見てみます。 他に何かご存知の方おられましたら教えていただけると助かります。

(無題) 削除/引用 No.2596-3 - 2009/01/04 (日) 20:46:01 - ~ Nalm-6のことですかね。 PMID: 18370065 がMethodologyの論文ですので、参考になりませんか？

(無題) 削除/引用 No.2596-2 - 2009/01/04 (日) 19:31:44 - ぷうちゃん 具体的に細胞名出した方がいいんじゃ

ノックアウト細胞の作成方法 削除/引用 No.2596-1 - 2009/01/04 (日) 18:37:35 - じゃぱん ノックアウト細胞の作成方法を教えていただきたくトピック作成をいたしました。作成方法が掲載されているサイトや本があれば教えていただけますでしょうか？ siRNAを用いたノックダウンの系で実験を行っていたのですが、ノックアウトの細胞が作れればと思っております。対象はヒトの癌細胞株を用いていたのですが、その細胞がミスマッチ修復遺伝子に異常をもつ細胞で組み替えを起こしやすく、よくノックアウト細胞の作成に使用されているもののようで、自分でも作れないかと思っております。詳細な実験方法が記載されている参考文献をご存知の方がおられたら教えていただけないでしょうか？ また、経験済みの方がおられたら注意点等教えていただけると助かります。 宜しくお願いします。

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