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(無題) 削除/引用 No.2585-12 - 2009/01/07 (水) 19:16:51 - mom-a >融解曲線では、本来のピークのちょっと下にちっちゃなピークが一つできます。で、やはりこれはあまりよくないのかなと思ってやめました。 >電気泳動してみると、予定の100bpのバンドは薄く200とか400位にバンドが出てしまい、 融解曲線がシングル・ピークでない、電気泳動して複数のバンドが出る、いずれもPCR産物が複数できているということになりますからアウトです。 ちょっと気になるのですが、 >増幅効率ですが、現在は50％程度です。（10倍希釈で　スロープが　−２ちょっと位だから　） 検量線はどう引いて、どのように増幅効率を計算していますか？ 下記のサイトを参考にすると、傾き-2というのは200%を超えていることになります…（50%にせよ、200%にせよ、私はあまり好ましくない条件だと思いますが）。 http://www.appliedbiosystems.co.jp/website/jp/biobeat/contents.jsp?COLUMNPGCD=77550&COLUMNCD=76448&TYPE=C&BIOCATEGORYCD=7#3 >理論的には検量線での補正は増幅効率差も補正しますから というご意見もあり、確かにそこが検量線を立てる利点の1つだと思いますが、とはいえ、増幅効率が100％±20％よりも外れるというのは、そもそもきちんと増幅していないということなので、キモチワルイ…私は（検量線を立てていますが）条件設定をやり直す、プライマーを変えるなどして増幅効率が良い状態で実験することにしています。PCR産物のサイズに関しては300bpくらいでもやったことがあります。 >35サイクル以降で立ち上がってくるのですが SYBR Greenで35サイクルよりもサイクル数が多いところで比較するのはなかなか難しいかもしれません。（処理をするとものすごく増える、などの場合なら大丈夫かもしれないので場合によりますが。） 検量線は何サイクルまで直線性が確認できていますか？R二乗の数値が高いようでも、線分の両端では逆推定するときの信頼区間の幅が広くなりますし、傾きが小さいと思っているほどきちんと定量できていないものです。 >ところでみなさんは、プライマーを作られる時はSNPはちゃんと避けて作っていますか？ この件に関しては、私は今まで気にせずにやっていました。

(無題) 削除/引用 No.2585-11 - 2009/01/07 (水) 11:23:07 - 123 条件検討が目的でなければこんなのを利用してみたら http://www.roche-biochem.jp/products/genomics/upl/upl-intro/index.html お試しサンプルも貰えたし。

(無題) 削除/引用 No.2585-10 - 2009/01/07 (水) 03:06:06 - 免疫屋 >[Re:7] ザンギさんは書きました : > >免疫屋さん > >検量線を引くことを前提にすれば増幅効率の確認すら無視できるのではないかと思います． > > これって、そうなんでしょうか。 > 自分の経験ではそう思えませんが。 きっちり検量線が引ければ，少なくとも増幅効率については無意味な指標となると考えますけれど違うかな？ 理論的には検量線での補正は増幅効率差も補正しますから，検量線による定量がうまくいかないとしても増幅効率に依存する可能性は低いと考えますが．．．

(無題) 削除/引用 No.2585-9 - 2009/01/07 (水) 00:58:11 - natu >35サイクル以降で立ち上がってくるのですが、その後、電気泳動してみると、 >予定の100bpのバンドは薄く200とか400位にバンドが出てしまい、 >結局あまり高サイクルだと信頼性が低いのかな、と思っています。 配列によって増幅効率が違うので一概には言えませんが、 35サイクルはちょっと遅いような気がします。 200や400のバンドというのは非特異的な増幅の可能性がありますよ。 >もっと効率の良いプライマーと条件を求めて作り直した方がいいでしょうか？？？ >それとも、あまりなれていない自分が四苦八苦するよりタックマンを買ってやった方が現実的でしょうか？？？ プライマーを検討する方がいいと思います。 TaqManは高価なうえに注文に時間がかかるので、 高い特異性を求めるのでなければオススメできません。

ありがとうございます 削除/引用 No.2585-8 - 2009/01/06 (火) 12:54:21 - リアルタイムの条件 お正月から、皆様詳細なご返答ありがとうございます。 年末に作っておいた、別のプライマーを含めて年末年始に条件設定をやり直してみました。 産物が300bp位のプライマーの融解曲線では、本来のピークのちょっと下にちっちゃなピークが一つできます。で、やはりこれはあまりよくないのかなと思ってやめました。 現在、別のプライマーで（産物は100bp）きれいな融解曲線ができるので、これで実験しています。 最終的には、35サイクル以降で立ち上がってくるのですが、その後、電気泳動してみると、予定の100bpのバンドは薄く200とか400位にバンドが出てしまい、結局あまり高サイクルだと信頼性が低いのかな、と思っています。（理論上はnet primerにかけてみると、ダイマーができる可能性がありました。） ところでみなさんは、プライマーを作られる時はSNPはちゃんと避けて作っていますか？ どうも僕のターゲットはensembleでチェックするとSNPがたくさん載っていて、いまいちうまくできないのですが・・・・ （ソフトはplimer３　で　配列はemsemlbe からエキソンをつなぎ合わせ作っています。でイントロンをはさむように設計しています） それから、先ほども話題にでていた増幅効率ですが、現在は50％程度です。（10倍希釈で　スロープが　−２ちょっと位だから　） もっと効率の良いプライマーと条件を求めて作り直した方がいいでしょうか？？？ それとも、あまりなれていない自分が四苦八苦するよりタックマンを買ってやった方が現実的でしょうか？？？ 先ほど書かれていたように、検量線がきれいに引けていれば（Ｒ2は0.98あります）増幅効率は無視できるのであれば、ありがたいのですが、みなさんはどうお考えでしょうか？？ ややこしくてすみませんが、よろしくお願いします。

(無題) 削除/引用 No.2585-7 - 2009/01/06 (火) 12:44:05 - ザンギ >免疫屋さん >検量線を引くことを前提にすれば増幅効率の確認すら無視できるのではないかと思います． これって、そうなんでしょうか。 自分の経験ではそう思えませんが。

(無題) 削除/引用 No.2585-6 - 2009/01/06 (火) 10:18:38 - 免疫屋 定量PCRの産物について小さな産物が推奨されている理由としては， 「150 bp以下の産物については1サイクル毎の増幅効率がx2にほぼ等しくなる」 という説明をメーカーから受けたことがあります（根拠については特に聞いていませんが）． 確か検量線を引かないcomparative Ct（ΔΔCt）methodでは，targetとinternal controlのPCR増幅効率が等しいことを前提にしているはずですので，本方法にて相対定量する場合の処置として短い産物を推奨しているのでしょう．． もちろん短くすることと増幅効率が等しくなることは同義ではありませんが，そうなる可能性を高めるための方策として現在でも推奨しているのだと思います． 逆に言えば，増幅効率が（targetとinternal control間で）ほぼ同一であると確認できるならば，300bpでも良いことになります．また，検量線を引くことを前提にすれば増幅効率の確認すら無視できるのではないかと思います．

(無題) 削除/引用 No.2585-5 - 2009/01/01 (木) 13:50:59 - おお 短い方が増幅効率がいいというのもあったとおもいます。 ま、だから非特異も出にくいんだということにもなりますが。 あとは検出系によってはノイズが減らせるのではなかったかなと。 インターカレーター(エチブロとか)を使うぶんには 300でもちょっと大きいけどま、いいかと思えますね。

(無題) 削除/引用 No.2585-4 - 2009/01/01 (木) 13:18:10 - ザンギ 定量PCRの産物は小さいほうが非特異的なDNA増幅を抑制できる可能性が高いから好まれているに過ぎません。 300bpでもメルティングカーブがきれいなシングルピークになれば問題ないです。付け加えると、電気泳動上でシングルバンドであっても、バックグラウンドにスミアに流れる長さの定まらない非特異的増幅産物はよくあるので、ご注意ください。 エチブロにしろサイバーにしろ２本鎖DNAに非特異的に結合するので、同じ分子数なら長いDNA鎖がよりシグナルが強く出ます。

(無題) 削除/引用 No.2585-3 - 2008/12/31 (水) 17:59:11 - おお >[Re:1] リアルタイムの条件さんは書きました : > PCRのプライマーと産物について教えてください。 > > > また100bp位の産物を確認する時はアクリルアミドゲルの方がいいのかなあなどと思うのですが、アガロースとアクリルアミドがどのぐらい違うものか、ご存知の方がおられれば教えてもらえないでしょうか。 何について詳しく知りたいのか分かりませんが30:1のPAGEで6%で600ー50bp くらいできれいに分かれています。じっさいは50あたりはほとんど見ないので 厳密な分解能はいえませんが、、、、 300-100のレンジなら8ー10%ぐらいでもいいかもしれません。分解能的には 良い所で数ベースの差はじゅうぶん見分けれます。気を使うと1ベースのさも 見れるかもしれません。ローディングバッファーはフィコールを使ったものがベストです。バンドが逆への字型に ならないので。 一度カタログでマーカーを調べてみれば、小さなマーカーであればPAGEの イメージが載っていたりしますので、眺めていてはどうでしょうか、、、 じっさいは30:1より40:1のほうがポピュラーだったような気がします。 若干へいどうパターンが違うと思いますが、どれで始めるか決めてしまえば いいだけのことだと思います。 qPCRについては、知識的にはお答えできる範疇ですが、経験を積んだかたにコメント をゆだねたいと思います。

PCRのプライマーと産物 削除/引用 No.2585-1 - 2008/12/31 (水) 16:50:33 - リアルタイムの条件 PCRのプライマーと産物について教えてください。 遺伝子発現検出のRT-PCRのプライマー及び条件の検定をしています。 産物のアガロースゲル電気泳動では、10年ぐらい前の論文から引用した プライマーが一番よく検出できています。 しかしこのプライマーだと、産物は300bpちょっとぐらいの大きさになります。（これは計算しても予想通りで問題ありません） PCR（特にリアルタイム）の本を読んでいると、ほとんどのもので、 プライマーを作る時は産物はもっと小さいサイズにするように書いてます。 今後サイバーグリーンでリアルタイムも予定しているのですが、産物が大きいと問題があるのでしょうか？ RT-PCRの産物確認は2％アガロースゲルでエチブロを使用しています。 同じmRNAをいくつかのプライマーでチェックしているのですが、出来上がった300bp位の産物と100bp位の産物を流すと300ぐらいの方が強く光ります。これは300bpの方が大きいから100bpの3倍良く光って見えるということでしょうか？それとも単にプライマーの性能の違いというべきものなんでしょうか？ また100bp位の産物を確認する時はアクリルアミドゲルの方がいいのかなあなどと思うのですが、アガロースとアクリルアミドがどのぐらい違うものか、ご存知の方がおられれば教えてもらえないでしょうか。 PCR自体初心者で回りに余り詳しい方がいない為、初歩的な内容だと思いますがよろしくお願いします。

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