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(無題) 削除/引用 No.2583-6 - 2009/01/03 (土) 12:41:59 - AP 鋳型の希釈列をつくるのはPCRの段階でいいのか、逆転写の段階にすべきか、という質問だと思います。 qPCRで鋳型の希釈列を作るのは、PCR反応が測定に適正なレンジに収まるポイントを選ぶためと、dose-dependentに応答しているかを見ることで測定値の信頼性を証明するためであると理解しています。この意味で、PCRの段階でcDNAの鋳型の希釈列を作るのには意義があります。 一方、内部標準はサンプルごとの逆転写効率のばらつきをnormalizeするためで、一反応のなかではどのRNA種も一定の効率で逆転写されるという前提です。逆転写の段階で、RNAの鋳型の希釈列を作れば、逆転写効率がそれぞれ異なるでしょうけれど、一反応の中ではすべてのRNAの逆転写効率が同じ割合だけ変化すると考えるので、希釈率を変えても同じことを繰り返してやっているだけで、あまり意味がないでしょう。たとえ、RNA種によって、希釈による逆転写効率の影響が多少違うことがあっても、それ以上にサンプルごとの逆転写効率の違いの影響のほうがよっぽど大きいので、この段階で希釈列を作っても何を見ようとしているのかわかりません。 なお、以前のトピで取り上げられていましたが、希釈列を作るときは、チューブなどへの鋳型の吸着に留意してください。鋳型が微量になるほど吸着によるロスの影響が大きくなるので、吸着を防がないと希釈率以上に測定値の低下が起こります。

(無題) 削除/引用 No.2583-5 - 2009/01/03 (土) 04:58:42 - あべちゃん 昔、ヒト遺伝子のはつげん量変化をリアルタイムを用いて、網羅的に調べている研究所とかかわりがありました。 そこでは、トータルＲＮＡを抽出したら、逆転社反応はすべての遺伝子について条件を統一していました。 サンプルはいくつかの組織と培養細胞から得られたＲＮＡミックスを使ってました。 そして、ｃＤＮＡを鋳型にＰＣＲ反応で低了する際も、元のトータルＲＮＡ量を元に （たとえば、２０uLの反応系でトータルＲＮＡを１ug使用したならば、そのｃＤＮＡサンプルは５０ng/uL RNＡとして扱う） 一定ＲＮＡ量（5ng/20uLの反応系）でリアルタイムＰＣＲしていました。 大量サンプルをコストを考慮してやっていた研究所なので、この方法はかなり確実だと思います。 その際、ＰＣＲで用いるオリゴが、増幅しないとか単一バンドで無いとかの場合は、さっさと諦めて次のオリゴを発注していました。 それで、上手くいくオリゴが見つかれば、Realtime酸がおっしゃるように、ＲＮＡではなくｃＤＮＡの量を原液からバイバイ希釈で８段階振って定量していました。 標準サンプルはハウスキーピング遺伝子を使います。 しかし、最近指摘されているように、ＧＡＰＤＨだけではだめで、アクチンやＰＧＫなど複数のハウスキーピング遺伝子を使用するのが、より信頼性の高い結果を得る事になります。 最後に、普段使用していない実家のパソコンなので文字変換のミスはお見逃し下さい。

(無題) 削除/引用 No.2583-4 - 2009/01/03 (土) 02:44:15 - Rea ＞ザンギさんへ ありがとうございます。プラスミドは使わず、コントロール遺伝子を用いた相対法で解析する予定です。 ＞natuさんへ ありがとうございます。自分が使うRNA量は使用するRTキットの適量内であると思われるため、cDNAを用いて希釈系列を作って実験をします。

(無題) 削除/引用 No.2583-3 - 2009/01/02 (金) 17:40:53 - natu それで大丈夫だと思いますよ。 5倍か10倍ずつくらいで希釈系列を作成し、 直線に乗る範囲内に見たいサンプルが収まればOKでしょう。

(無題) 削除/引用 No.2583-2 - 2009/01/01 (木) 12:55:55 - ザンギ cDNAってプラスミドクローンのことでしょうか？ 理想的ではないけれども、それでは全くだめということでもないと思います。 ただ、プラスミドだけを鋳型にしてプライマーのチェックをしても、測定試料ではワークしないことはあるので、かならず「cDNA」なりmRNAなりでも希釈系列をつくって定量性をチェックすることは必要です。 逆転写反応液の持込が定量PCRに影響したりしますし、ランダムプライマーでの逆転写が他の遺伝子転写産物に影響されないかと考えれば影響はあるでしょうし。 完全なコントロールはないんだと思ってしまえば、現実的な方法で妥協することもありだと思えます。

Real time RT-PCRの希釈系列 削除/引用 No.2583-1 - 2008/12/31 (水) 13:57:35 - Realtime Real time RT-PCRの希釈系列を作成する予定です。逆転写の効率がRNA濃度により変化してしまうのであれば、RNAを用いた希釈系列の作成が必要かもしれませんが、逆転写酵素が高いので、できればcDNAで希釈系列を作りたいと思っています。逆転写キットの説明書に示されているRNA量から外れないようにして、用いている場合にはcDNAで希釈系列を作成しても問題ないのでしょうか？

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