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ありがとうございます。 削除/引用 No.258-5 - 2007/09/29 (土) 17:26:03 - 細胞実験初心者 CaPさん，ありがとうございます。 > RSVも決して弱いプロモータではありませんが、使用する細胞の種類によっては結構差が出たりします（CMVも同様）。その「強いはず」のRSVプロモータ（なんですよね?しつこいようですがSV40プロモータ・エンハンサーpSVbeta-galではないんですよね?）で活性が出ないというのは納得できません。ルシフェラーゼのレポーターは「まずまずの値」だと仰ってますが、これはバックグラウンドより十分に高いものですか? トランスフェクションの効率についてはどうお考えですか? 確認ですが，β-ガラクトシダーゼ発現ベクターはRSV β-galです。 あと，具体的に言えば，HepG2細胞でリポフェクタミン2000を用いてトランスフェクションしています。ルシフェラーゼアッセイの時の値はバックグラウンドよりも十分高い値になっています。トランスフェクション効率も悪いようには思われません。 今回は実験系の都合がありinternal contorlはβ-ガラクトシダーゼを使っていますが，以前に同じHepG2でホタルルシフェラーゼをレポーターに，レニラルシフェラーゼをinternal controlとしてアッセイしていた（リポフェクタミン2000を用いて）ことがあるのですが，このときも当初pRL-tkをinternal controlとして用いていたのですが，やはりレニラルシフェラーゼの値が低かったときがあり，その時はpRL-SV40に変えたということもありました。 ですので，前の経験から則すと，やはりCaPさんの仰るとおり量を増やすだけではいけないのではないかと思っています。ですので，現時点ではCaPさんの御意見などからも併せて， ・pSV-β-galactosidase control vectorに変える ・RSV β-galactosidase vectorのままでキットを変える ことを考えています。 > 自分なら徹底的にコンストラクトを確認した上で、正しければCMV等他のプロモータを使うか、ルミノメータで測定できるキットに変更すると思います。もしトランスフェクション効率の問題なら、違う方法を試すか、ウイルスベクター等の導入も考えられるでしょう。 この場合の「徹底的にコンストラクトを確認」というのはプラスミドのクオリティ（例えば切断されてしまっていないとか）を指すのでしょうか？ アドバイスよろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.258-4 - 2007/09/29 (土) 12:32:50 - CaP RSVも決して弱いプロモータではありませんが、使用する細胞の種類によっては結構差が出たりします（CMVも同様）。その「強いはず」のRSVプロモータ（なんですよね?しつこいようですがSV40プロモータ・エンハンサーpSVbeta-galではないんですよね?）で活性が出ないというのは納得できません。ルシフェラーゼのレポーターは「まずまずの値」だと仰ってますが、これはバックグラウンドより十分に高いものですか? トランスフェクションの効率についてはどうお考えですか? 仮に量を増やしたとして、数倍増やしたらバックグラウンドより十分高い値が出るでしょうか? 10倍以上増やさない限りあまりそうは思えません。自分なら徹底的にコンストラクトを確認した上で、正しければCMV等他のプロモータを使うか、ルミノメータで測定できるキットに変更すると思います。もしトランスフェクション効率の問題なら、違う方法を試すか、ウイルスベクター等の導入も考えられるでしょう。

ありがとうございます 削除/引用 No.258-3 - 2007/09/29 (土) 07:56:27 - とある大学院生 CaPさん，ありがとうございます。 > βgalアッセイを吸光度計でされているとのことですが、Promegaのキットでしょうか。 そうです。プロメガのキットを使っています。 > 非常に低い、とありますが、バックグラウンドに対してどの程度のレベルなのでしょうか。感度の良いルミノメータで測定するであろうルシフェラーゼの値と直接比較してもあまり意味はないと思います。 > 精製βgalで作成した検量線の直線部分に乗っていればいいのではないでしょうか。もしもあまりにも低く＝バックグラウンドと変わらないのであれば、内部コントロールに使っているコンストラクトを疑うか、アッセイキットを検証するのもまずすべきことでしょう。 具体的には，バックグラウンドとほとんど変わらないか，若干高い状態で，キットの説明通りに準備したstandardには乗らない状態です。 実は別のプロモーターを持つβ－ガラクトシダーゼベクターへ変更することも選択肢の一つとして考えたのですが・・・，RSVでも十分強いので量の調整でできるのではとおっしゃる先生もおられたので・・・。 あと，キットをPIERCE社のものに変えるとか，同じプロメガ社のルミノメーターを使ってβ－ガラクトシダーゼを測定するキットがあると思うのですが，そういうものを使うのは如何でしょうか？ アドバイスお願いします。

(無題) 削除/引用 No.258-2 - 2007/09/29 (土) 06:24:05 - CaP βgalアッセイを吸光度計でされているとのことですが、Promegaのキットでしょうか。 非常に低い、とありますが、バックグラウンドに対してどの程度のレベルなのでしょうか。感度の良いルミノメータで測定するであろうルシフェラーゼの値と直接比較してもあまり意味はないと思います。 精製βgalで作成した検量線の直線部分に乗っていればいいのではないでしょうか。もしもあまりにも低く＝バックグラウンドと変わらないのであれば、内部コントロールに使っているコンストラクトを疑うか、アッセイキットを検証するのもまずすべきことでしょう。 どうしても値そのものをあげたいのであれば、lysateを今より多く使うとか、pSVbeta-galではなくCMV等強めのプロモータでドライブされているガラクトシダーゼを使うという手もあると思います。（書かれておられるとおりRSVプロモータだったとしてもCMVより弱いと思います） ですから2.についてはあまり現実的でないという気がします。

細胞へのレポーター遺伝子導入について 削除/引用 No.258-1 - 2007/09/28 (金) 22:29:00 - とある大学院生 レポーター遺伝子と内部コントロール用ベクターを一緒に一過性に導入しレポーター活性を測定する実験を行っているのですが，諸先輩に教えてほしいことがあります。 問題なのは，内部コントロール用に導入しているRSV β-ガラクトシダーゼベクターについてなんですが， １．細胞溶解液を用いてβ－ガラクトシダーゼアッセイ（吸光度計で測定）しているのですが，吸光度が非常に低いのです。レポーターコンストラクト（ルシフェラーゼベクター）のルシフェラーゼ活性はまずまずの値なのでトランスフェクションの効率自体は悪いとは思わないのですが・・・。何か原因があるのでしょうか？また，何か対策はあるでしょうか？ ２．１に関連しているのですが，トランスフェクションするβ－ガラクトシダーゼベクターの量を増やすことがその対策の１つではないかと考えています。ですが，一般に内部コントロールはレポーターベクターの1/3-1/5以下の量でトランスフェクションすると書かれていると思うのですが，それ以上に増やしてもよいのでしょうか？極端に言えば，レポーターベクターの量より内部コントロールの量よりも多くしても影響はないものなのでしょうか？ 結構悩んでいます。 何卒お願い致します。

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