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(無題) 削除/引用 No.2569-3 - 2008/12/31 (水) 15:54:52 - EcoRI 巻き戻しについては、やったことがないし、それに、なんか気持ち悪いので、 １のみ、ということにさせていただきます。 目的のタンパクが10~15kDaということで、融合タンパク質は40kDa前後と思いますが、 問題の26kDaのバンドはanti-GSTで染まりますか？ 1) 染まるなら、おおさんの仰る通り分解が起きているのかもしれません プロテアーゼインヒビターカクテルなどを用いてみましょう。 26kDaも込みのサンプルにタグ除去処理して、もう一度GSTカラムにかけても、除けるかもです。 2) 染まらないなら、なんですかね。よくわかりませんが、ゲル濾過などで除いてしまうのも手ですね。 発現コンストラクトを持った大腸菌からプラスミドを精製して、シーケンスを読むとどうでしょうか？ B株系は、制限系の遺伝子に変異が入ってないので、もしかすると、変異が起きているのかも… 可能性は低いと思いますが。

(無題) 削除/引用 No.2569-2 - 2008/12/26 (金) 17:21:44 - おお まず26kDaができる問題ですが、 おそらく目的のタンパクができたあと分解されてるのが、 一つの原因かと思います。一番単純な解決方法は、 GSTカラム後さらに精製することです。Cー末にHISとかつけておけば 精製は楽になります。 そのほかに考えられる解決方法は、そういう場合可溶画分が26kDaに 目立つ場合が多いので、まずPBSで大腸菌を凍結するなどで壊して (弱いソにケーションとかも加えるオプションもあると思いますが) フリーのGSTを遊離させて、デタージェンとで溶解する(-1%TRITONなど) が考えられるかもしれません(今思いつきました)。 >２．不溶画分に行くことが多いのですが、GSTのリフォールディングはやはり難しいのでしょうか？ 幾らか方法があるようですがNラウリルサルこしルにはGSTは耐性のようです。 なので、この界面活性剤を使ったプロトコールはよくみかけます。 ただしGSTが大丈夫でもそのほかの部分はへんせいするかも知れません。

GSTタグについて 削除/引用 No.2569-1 - 2008/12/26 (金) 16:25:01 - タンパク質は大変だ いつも参考にさせていただいております。 ここ何ヶ月間か、いくつかのタンパク質をGST融合で作成しております。目的のタンパク質はどれも10-15kDの小さめのタンパク質です。ベクターはpGEX6P-1を使用しております。 実験を行っている中で気になったというか、困っていることがあり、それに関連して2点質問させて下さい。 １．コンストラクトはきちんとできているのに、GSTのみ？(約26kD)のタンパク質がやたらと誘導されてくるのは何故でしょうか？ コンストラクトにフレームシフトやストップコドンの挿入のようなことは起きていないのに、タンパク誘導すると26kDのタンパク質にも同時に誘導がかかるようです。精製すると目的のサイズのタンパクもとれますが、このタンパク質も一緒にとれてきます。融合させるタンパク質によっては26kDのこのタンパク質の方が多いこともあります。 これは何が原因なのでしょうか？レアコドンの問題かと重いロゼッタを使用してみましたが改善されませんでした。また、低温誘導やIPTG濃度の検討なども行ってみましたが、大きな改善はみられませんでした（目的のタンパク質の方が、26kDのタンパク質よりも誘導されやすくなることもありましたが、26kDのタンパク質が無くなることはありませんでした） ２．不溶画分に行くことが多いのですが、GSTのリフォールディングはやはり難しいのでしょうか？ 上記とは違い、目的のサイズのタンパク質が大量に誘導できることもあるのですが、不溶化してしまうことがよくあります。 http://www.cosmobio.co.jp/product/raku/01190005.asp のようにGSTを巻き戻すキットもあるようですが、結構な値段がします。 もう少し安価な方法で、GSTのリフォールディングを試された方がおられましたら、その時の方法と精製効率（レジンにきっちりくっついたか）を教えていただけませんでしょうか？ もちろんHisやMBPなどにタグを変更するというご意見もあるかと思いますし、実際に私もタグ変更は行っております。しかし、とりあえず今回はタグ変更という提案は抜きで、ご意見をお聞かせいただければと思います。 よろしくお願いします。

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